調控γδT細胞受體對腦缺血再灌注小鼠Treg及細胞因子的影響①

劉宏為 李冶秋 王 勇 朱宏飛 （天門市第一人民醫院神經內科，天門 431700）

心臟驟停（cardiac arrest，CA）是嚴重危害人類生命健康的疾病之一，雖然快速有效的心肺腦復蘇（cardiopulmonary-cerebral resuscitation，CPCR）可減輕CA 的危害，但其病死率仍然很高，主要原因為器官缺氧缺血后再灌注損傷［1-4］。研究表明，大腦對缺血缺氧非常敏感，其損傷是CA 患者的主要死亡原因，67.7%院外和22.9%院內CA 患者死亡由腦損傷所致，僅12.3%CA 患者在CPCR 后具有良好的神經功能預后［5］。因此腦功能恢復是CPCR的關鍵。

近年T 細胞在心肌缺血/再灌注損傷中的作用逐漸被揭示，其缺失可減輕全腦缺血再灌注損傷［6］。γδT 細胞是一種作用介于固有免疫和適應性免疫的T 細胞，其分泌的細胞因子IL-17A 可增加心肌梗死面積，但其在CPCR 后全腦缺血再灌注損傷發病機制中的作用研究較少［7］。本研究建立小鼠CPCR 模型，探究γδT 細胞受體拮抗劑對Treg 及相關細胞因子的影響，旨在為研究γδT 細胞受體在CPCR 后全腦缺血再灌注損傷發病機制中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 100 只SPF 級健康成年雄性C57BL/6 小鼠，7~9 周齡、體質量 20~25 g（合格證號：11400700257295），購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（京）2016-0006］。置于12 h 光/12 h暗（光照時間7：00~19：00）、（22±2）℃、（52±2）%濕度環境飼養，自由飲食和飲水。本研究所有動物實驗均按照國家相關法律及動物倫理學要求在武漢大學動物實驗中心進行。

1.1.2 主要試劑及儀器 ELISA 試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）、RIPA（強）組織細胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、PBS磷酸鹽緩沖液購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；甲醛、無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、TEMED、過硫酸銨購自美國 Sigma；PVDF 膜、化學發光試劑、UPT 優普特實驗室超純水器購自法國Millipore；小動物呼吸機購自美國Harvard Apparatus；正置顯微鏡購自德國Leica；移液器購自法國Gilson；酶標儀、洗板機購自芬蘭Thermo Labsystems。

1.2 方法

1.2.1 CA-CPCR 模型構建 小鼠麻醉后插管，連接小動物呼吸機行機械通氣，小鼠各項指標維持如下標準10 min：直腸溫度（Trec）為（37.0±0.5）℃，呼吸末二氧化碳分壓（EtCO2）35~45 mmHg，心率（HR）>200 次/min，動脈血壓（MAP）>60 mmHg，靜脈注射70 μl 0.5 mol/L（4 ℃）KCl，關閉呼吸機誘導小鼠CA，心電圖活動停止且動脈血壓迅速下降至<10 mmHg即為誘導成功。經過6 min 的CA 后，手動進行CPCR（胸外按壓，約300次/min），靜脈注射0.5 ml腎上腺素（生理鹽水溶解，16μg/ml），重新以190次/min機械通氣，胸部按壓根據MAP和EtCO2調整，如小鼠2.5 min 內未恢復自主循環及呼吸則宣布失敗。MAP<50 mmHg 時，靜脈注射0.1~0.2 ml 腎上腺素生理鹽水溶液（16μg/ml）；自主呼吸恢復至60次/min后45 min 停止呼吸機，拔除氣管導管及各種導管并對傷口進行閉合處理，放回籠中飼養。

1.2.2 神經功能評分 小鼠蘇醒后參照LONGA等［8］5 分制法進行神經功能評分。0 分：無神經功能缺損體征；1 分：左側前肢不能完全伸展；2 分：大鼠行走時向左側轉圈；3 分：大鼠行走時身體向左側傾倒；4 分：意識喪失，不能自發行走。分值越高表示神經功能缺損越嚴重，其中1~3分者為實驗對象，因麻醉未清醒和經解剖證實為蛛網膜下腔出血者不計入實驗組。

1.2.3 分組及處理 實驗共分為3 組：對照組（無CA/CPCR 組）、CPCR組（誘發CPCR后全腦缺血再灌注損傷）；CPCR+γδT細胞受體拮抗組（CPCR 處理后立即腹腔注射γδT 細胞受體拮抗藥物UC7-13D5，250 μg，2 d），每組 30 只，對照組及 CPCR 組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.4 小鼠動脈血收集 放血處死小鼠后快速斷頭取腦，去除嗅球、小腦及腦干等，留取大腦，各組取部分腦組織固定，進行病理學檢查、免疫組織化學檢查和神經元凋亡檢查，其余腦組織?70 ℃凍存待檢。

1.2.5 TUNEL 凋亡檢測腦組織損傷 參照試劑盒說明書進行：取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 組織塊，置于10%甲醛固定48 h，流水沖洗并逐級脫水，移入石蠟液中包埋，置于?20 ℃冰箱中30 min 以上切片，TUNEL 檢測液處理樣品，PBS 沖洗 3 次，蘇木素復染，脫水，透明，封片，光鏡下檢查，顯微鏡拍照，Lecia Applaction Stiue圖像系統分析樣本相關部位。

1.2.6 HE 染色觀察神經元損傷 切片，水浴展片，撈片，將切片小心貼附于載玻片，染色：常規脫蠟，水洗1~2 min，蘇木精染色3~6 min，流水洗去蘇木精1~2 min，1%鹽酸乙醇處理1~3 s，水洗1~2 s，促藍液返藍5~10 s，流水沖洗15~30 s，0.5%伊紅染色2~3 min，蒸餾水洗 1~2 s，80%乙醇清洗 15~30 s，95%乙醇清洗15~30 s，無水乙醇清洗1~2 s，二甲苯清洗2~3 s，新的二甲苯清洗2~3 s，中性樹膠封固，顯微鏡拍照，Lecia Applaction Stiue 圖像系統采集分析樣本相關部位。

1.2.7 ELISA 測定 MPO、TNF-α、IL-6 和 IL-1β 濃度 ELISA 試劑盒檢測 TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度及MPO活性，按試劑盒使用說明書操作。

1.2.8 Western blot 檢測腦組織Foxp3 蛋白表達將組織剪成細小碎片，按每20 mg 組織加入150~250μl 裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿至完全裂解，4 ℃、12 000 g 離心 15 min，取上清，按 BCA 試劑說明書進行蛋白質定量，?80 ℃貯存。配制12%SDS-PAGE膠，根據蛋白定量結果取所需蛋白，加入適量緩沖液，沸水浴 10 min 后離心取上清，20 μg/孔上樣，濃縮膠80 V、分離膠120 V 電泳，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據說明書稀釋一抗，按所需稀釋濃度將一抗加入封閉液中，與膜共同室溫孵育1 h，PBST 洗滌3次，5 min/次。根據用量按1∶10 000稀釋HRP標記的二抗，室溫孵育 1 h，PBST 洗滌 3 次，5 min/次，暗室中等量混勻ECL 發光液A、B，加在膜的正面與之充分接觸，全自動化學發光分析儀檢測。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，數據均采用表示。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL 觀察腦組織損傷 CPCR 組小鼠腦組織中神經元細胞凋亡較對照組增多，CPCR+γδT 細胞受體拮抗組較CPCR組細胞凋亡減少（圖1）。

圖1 TUNEL檢測各組小鼠腦組織損傷Fig.1 Damage of in brain tissue of mice in each group detected by TUNEL

2.2 HE 染色觀察神經元損傷 CPCR 組小鼠腦缺血灶中心區出現大量死細胞或細胞呈不規則狀態腫大，核膜破裂，細胞結構消失，CPCR+γδT 細胞受體拮抗組較CPCR組病理學改變有所緩解（圖2）。

圖2 小鼠HE病理染色Fig.2 HE staining of mice pathology

2.3 腦組織MPO活性、TNF-α、IL-6和IL-1β濃度測定 ELISA 結果顯示，CPCR 組 MPO 活性、TNF-α、IL-6 和IL-1β 濃度較對照組升高（P<0.05），CPCR+γδT 細胞受體拮抗組較 CPCR 組 MPO 活性、TNF-α、IL-6和IL-1β濃度顯著下調（P<0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠腦組織 MPO 活性、TNF-α、IL-6 和 IL-1β濃度Fig.3 Activity of MPO，concentrations of TNF-α，IL-6，IL-1β of mice in each group

2.4 Western blot 檢測腦組織Foxp3 蛋白表達Western blot結果顯示，CPCR組Foxp3表達較對照組顯著下調（P<0.05），CPCR+γδT 細胞受體拮抗組較CPCR組Foxp3表達上調（P<0.05，圖4）。

圖4 各組小鼠Foxp3表達Fig.4 Expression of Foxp3 of mice in each group

3 討論

CA 導致的腦缺血再灌注損傷會對神經系統造成較大傷害，患者可能出現意識或警覺性降低、記憶缺失、運動不協調和癲癇發作等輕微癥狀，嚴重者可發展為腦死亡［8］。國內外對CPCR 后全腦缺血再灌注損傷的研究多數集中于氧化應激、炎癥介質、神經細胞凋亡及鈣超載等方面［9-10］。近年研究顯示T 細胞在腦缺血再灌注損傷中也有重要作用［6］。本研究顯示，CPCR 組小鼠腦缺血灶中心區出現大量死細胞或細胞呈不規則狀態腫大，核膜破裂，細胞結構消失，CPCR+γδT細胞受體拮抗組較CPCR組病理學改變有所減輕，且細胞凋亡減少，提示γδT細胞在CA腦缺血再灌注中起重要作用。

炎癥反應是引發腦缺血再灌注損傷的重要原因，CA/CPCR 大鼠血清 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 濃度顯著升高，抑制炎癥反應對CA/CPCR 術后腦損傷保護具有重要意義［11］。研究發現，IL-1β、IL-6 等細胞因子在Th17/γδT細胞功能中發揮關鍵作用［12-13］。中性粒細胞為心肌缺血/再灌注損傷引起的炎癥反應相關免疫細胞［14］。MPO 是炎癥標志物，其活性可反映中性粒細胞的聚集程度［15-16］。Treg在心肌缺血/再灌注損傷中也發揮重要作用，可通過下調趨化因子減少嗜中性粒細胞浸潤［17］。Foxp3 作為 Treg 的重要標志因子，在Treg 發育、分化和功能維持等方面發揮重要作用［18-19］。TGF-β 誘導初始 T 細胞表達 Foxp3，促使初始T 細胞分化為Foxp3+Treg，發揮免疫抑制作用，分泌抑制性細胞因子平衡Th17 細胞分泌的促炎細胞因子（如 IL-6、TNF-α）［20］。本研究表明，CPCR 組小鼠腦組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等細胞因子濃度和MPO 活性均升高，Foxp3表達下調，提示CPCR 小鼠腦組織中存在嚴重炎癥反應，與病理觀察結果一致，經γδT細胞受體拮抗劑處理后，TNF-α、IL-6 和IL-1β 等細胞因子濃度和MPO 活性均降低，Foxp3 表達上調，提示拮抗γδT 細胞受體可抑制CPCR 小鼠腦組織炎癥反應，其機制可能與Treg 分化為Foxp3+Treg，從而進行免疫抑制有關。

綜上，本研究通過構建CA-CPCR 后腦缺血再灌注小鼠模型，了解到拮抗γδT 細胞受體可抑制小鼠腦組織炎癥反應，對Treg 分化具有間接調控作用，有助于機體調節免疫應答與免疫抑制反應的平衡關系，進而對CA-CPCR 導致的腦缺血再灌注損傷發揮一定改善作用，為臨床上降低CA-CPCR 后中樞神經系統損傷提供了參考。