miR-335 調控Survivin和NF-κB表達對B細胞淋巴瘤細胞侵襲、遷移和凋亡的影響①

邢麗娜 田 甜 王 穎 郭曉楠 （河北醫科大學第二醫院血液內科，石家莊 050051）

B 細胞淋巴瘤是來源于成熟B 細胞的惡性增生性疾病，其發病率居惡性腫瘤第五位［1］。臨床上對B 細胞淋巴瘤的診斷治療主要以化療和放療為主，但其具有易發生轉移和復發的特點，導致病死率居高不下［2］。Survivin 蛋白是凋亡抑制蛋白，是目前發現最強的凋亡抑制基因。研究表明，淋巴瘤的轉移和復發與Survivin 蛋白的表達密切相關，Survivin 蛋白主要通過抑制Caspase-3 和Caspase-7 活性從而抑制細胞凋亡，在腫瘤細胞的轉移中發揮重要作用［3-4］。NF-κB 是一種參與腫瘤細胞增殖和凋亡的重要核轉錄因子，其活性被抑制會引起腫瘤細胞凋亡。miRNA 通過調控腫瘤相關基因，與其靶基因mRNA特定位點堿基互補配對，形成轉錄復合物，抑制相關蛋白表達，發揮抑癌作用。研究發現：miR-335 在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程中發揮作用，如前列腺癌細胞、膀胱癌細胞和肝癌細胞［5-7］。目前國內外尚無針對miR-335在B 細胞淋巴瘤細胞中表達情況及作用機制的相關研究報道。本研究通過探討miR-335 在B 細胞淋巴瘤細胞中過表達對B 細胞淋巴瘤細胞Survivin 蛋白的表達水平及侵襲、遷移和凋亡能力的影響，分析其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 B 細胞淋巴瘤細胞株SU-DHL-4 購自中國科學院上海細胞庫，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基傳代培養；RPMI1640 培養基、胎牛血清購自杭州四季青公司；RNA 提取試劑、TRIzol 試劑購自 Invit?rogen公司；所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；逆轉錄試劑盒、PCR 擴增試劑盒購自美國Invitrogen 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑、鼠抗人Survivin 單克隆抗體和HRP 標記的山羊抗兔IgG 購自美國Abeam 公司；鼠抗人 NF-κB p65單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；Transwell 檢測小室購自上海生博生物醫藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染與分組 取對數生長期SU-DHL-4細胞，以0.25%胰酶消化，接種于96孔板，待細胞生長至80%融合時，置于無血清培養基12 h 后轉染。轉染分為對照組（不做任何處理）、空轉染組（轉染空載體）、過表達組（轉染miR-335），轉染均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 RT-PCR 檢測miR-335 表達水平 采用RTPCR 檢測miR-335 表達水平，取上述3 組細胞轉染48 h，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。參照GenBank 中的基因序列，利用Primer premier 6.0 軟件設計目的基因miR-335 的RT-PCR 引物，以 cDNA 為模板，應用 PCR 擴增儀進行擴增，操作嚴格按照PCR 試劑盒說明書進行。miR-335 正向引物：5'-CGTCCTCGTCAAGAGCAATAAC-3'；反向引物：5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCT?GTGTC-3'；內參 β-actin 正向引物：5'-CACGATG?GAGGGGCCGGACTCATC-3'；反向引物：5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。 反 應 條 件 ：25 ℃30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用 2?ΔΔCt法計算miR-335的相對表達量。

1.2.3 Western blot 檢測 Survivin 和 NF-κB 蛋白表達 取上述3 組細胞轉染48 h，加入適量細胞裂解液提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測提取蛋白的濃度，采用10%SDS-PAGE 分離，半干法PVDF 轉染，5%脫脂奶粉封閉，加入Survivin 一抗（1∶500）、NF-κB 一抗（1∶1 000）和β-actin 抗體（1∶1 000），4 ℃過夜，洗膜后加入HRP 標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜后采用增強化學發光法（ECL）顯色，以β-actin 為內參，目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值反映各蛋白表達，公式如下：蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。

1.2.4 劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 取上述3組細胞轉染48 h，懸液以3×104個/孔分別接種至96 孔板（100 μl），每組設 5 個復孔，37 ℃培養24 h，至細胞達到90%以上融合度，使用劃痕儀對準96 孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用RPMI1640 培養基輕輕漂洗，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，0 h、24 h 時在熒光顯微鏡下觀察拍照，計算各組細胞遷移率。

1.2.5 Transwell 檢測細胞侵襲能力 Transwell 小室內膜加入Matrigel 膠并置于24 孔板，待膠凝固后實驗。取3 組轉染48 h 的細胞，并調整細胞濃度為1×105個/ml，以 200 μl/孔將細胞懸液加入 Transwell小室，加入含10%小牛血清的RPMI1640 培養基800 μl，37 ℃培養24 h，取出小室，用棉簽擦拭內膜上的細胞，預冷甲醇固定30 min，棄甲醇，1%結晶紫染色20 min，倒置顯微鏡下隨機觀察5 個視野，并計穿膜細胞數，實驗重復6次取平均值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取上述3 組細胞轉染48 h，加入預冷PBS洗滌細胞，采用胰蛋白酶消化細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml，離心收集細胞，經Annexin V-FITC/PI 染色后，置于流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗步驟嚴格按照細胞凋亡試劑盒的操作。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0 統計學軟件，所有數據符合正態分布，以表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用獨立t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組B 細胞淋巴瘤細胞miR-335 表達水平比較 與對照組相比，空轉染組miR-335 表達水平差異無統計學意義（P>0.05），過表達組miR-335 表達水平明顯升高（P<0.05）；與空轉染組相比，過表達組miR-335表達水平明顯升高（P<0.05），見圖1。

圖1 各組B細胞淋巴瘤細胞miR-335表達水平比較Fig.1 Comparison of expression level of miR-335 in B cell lymphoma cells in each group

2.2 miR-335 過表達對 Survivin 和 NF-κB 蛋白表達的影響 與對照組相比，空轉染組Survivin和NF-κB蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），過表達組 Survivin 和 NF-κB 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）；與空轉染組相比，過表達組Survivin和NF-κB蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），見圖2。

圖2 各組B 細胞淋巴瘤細胞Survivin 和NF-κB 蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of expression levels of Survivin and NF-κB protein in B cell lymphoma cells in each group

2.3 miR-335 過表達對細胞遷移和侵襲能力的影響 與對照組相比，空轉染組細胞遷移率、侵襲細胞數差異無統計學意義（P>0.05），過表達組細胞遷移率和侵襲細胞數明顯降低（P<0.05）；與空轉染組相比，過表達組細胞遷移率和侵襲細胞數明顯降低（P<0.05），見圖3、4。

圖3 各組B細胞淋巴瘤細胞遷移率比較Fig.3 Comparison of cell mobility of B cell lymphoma cells in each group

圖4 各組B細胞淋巴瘤侵襲細胞數比較Fig.4 Comparison of invasion numbers of B cell lymphoma cells in each group

2.4 miR-335 過表達對細胞凋亡的影響 與對照組相比，空轉染組細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），過表達組細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與空轉染組相比，過表達組細胞凋亡率明顯升高（P<0.05），見圖5。

圖5 各組B細胞淋巴瘤細胞凋亡率比較Fig.5 Comparison of apoptosis rate of B cell lymphoma cells in each group

3 討論

B 細胞淋巴瘤是目前常見的成人淋巴瘤，大多數患者在接受治療后效果較好，但仍有1/3 患者出現治療無效和復發的情況。近年來，生物靶向治療成為腫瘤治療的新思路，尤其是利用基因靶向治療［8］。miRNA 作為重要的生物體基因調控分子，其在腫瘤治療中的應用已成為生物領域研究的熱點。miRNA是一種由19~25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，于細胞核中生成，具有高度保守性，成熟的miRNA 結合到與其互補的靶基因mRNA 位點繼而調控其靶基因表達，參與細胞的增殖、凋亡等生命過程［9］。如 miR-193b-5p 可通過靶向 CD44v6 在乳腺癌中發揮抑癌功能［10］；miR-145 通過靶向 HCT116 抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲、凋亡［11］。研究表明，miRNA 可通過抑制其靶基因Survivin 影響癌細胞的多種生物學行為，是膀胱癌潛在的治療靶點［12-13］。

Survivin 基因是1997 年發現的抑制基因，基因構成包含3個內含子和4個外顯子，是目前發現最強的凋亡抑制基因。Survivin 基因的表達產物Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族的最小成員，在絕大多數正常組織中不表達。研究表明，在惡性腫瘤組織中，Survivin 蛋白呈高表達水平，如直腸癌、乳腺癌、小細胞肺癌等［14-16］。Survivin 參與了腫瘤細胞的惡變和抗凋亡的生理過程，具有抑制細胞凋亡和調控有絲分裂兩個主要生理學功能，當Survivin 位于線粒體內時，機體表現為抑制細胞遷移，當其位于胞漿內時，表現為調節間期微管的穩定性，進而參與調節細胞周期［17-18］。Survivin 在惡性腫瘤組織中處于失衡狀態，是抗腫瘤治療的一個重要突破點［19-20］。NF-κB 是調控細胞凋亡的細胞因子，抑制 NF-κB 表達可促進腫瘤細胞凋亡。此外，NF-κB 參與Survivin轉錄過程：Survivin 可上調IKKp 啟動子的轉錄活性，提高IKKp在體內的表達水平，促進NF-κB活化，兩者有著密切聯系［21］。本研究顯示：B 細胞淋巴瘤細胞過表達 miR-335 后，Survivin 和 NF-κB 蛋白表達水平降低，細胞凋亡率增加，說明過表達miR-335可通過下調Survivin 蛋白表達，抑制NF-κB 蛋白表達誘導細胞凋亡。此外，細胞遷移率和侵襲細胞數明顯降低，提示miR-335 對抑制B 細胞淋巴瘤細胞遷移和侵襲具有一定作用。

綜上所述，上調B 細胞淋巴瘤細胞miR-335 表達可通過下調Survivin 表達，抑制NF-κB 蛋白表達，誘導細胞凋亡，并抑制細胞遷移和侵襲能力，能夠為B細胞淋巴瘤的生物靶向治療提供理論依據。