外泌體circRPPH1促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖和轉(zhuǎn)移①

陳 亮 王曉龍 曹天生 林 波 曹洪濤 楊建榮 張文偉 湯婷婷 倪志福 王 波

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬花都醫(yī)院胃腸外科，廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院，廣州 510800）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均逐年提高［1-2］。目前，CRC 的主要治療方法仍是手術(shù)切除，適當(dāng)情況下輔以化療和放療，雖然可提高CRC患者五年生存率，但預(yù)后及復(fù)發(fā)主要取決于其病理分期，因此并未得到理想改善［3-4］。基于此，研究CRC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的有效分子靶點(diǎn)，早期預(yù)防和合理治療對提高CRC 患者生存率具有重要意義。

外泌體是細(xì)胞釋放到外環(huán)境的一類微小囊泡，其作用細(xì)胞外載體介導(dǎo)了癌細(xì)胞與其微環(huán)境的相互作用，在癌癥發(fā)展中起重要作用［5］。外泌體中包含的物質(zhì)有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等，可傳遞到不同類型細(xì)胞，發(fā)揮免疫應(yīng)答、抗原呈遞、細(xì)胞間通訊等多種功能［6-7］。circRNA 是一種無 3'端和5'端的閉合環(huán)狀非編碼RNA，近年越來越多證據(jù)表明，circRNA 在包括CRC 在內(nèi)的多種腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)控作用［8-10］。本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫，篩選CRC 組織中差異表達(dá)的circRNA，發(fā)現(xiàn)circRPPH1（hsa_circ_0000515）在 CRC 組織中呈顯著高表達(dá)，進(jìn)一步研究了circRPPH1 在CRC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用，并初步分析了其潛在的致癌分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CRC 組織樣本來源和細(xì)胞系 收集60 例CRC 患者腫瘤組織及對應(yīng)癌旁非腫瘤組織。所有患者均接受腫瘤切除術(shù)，術(shù)前未進(jìn)行放化療、免疫治療等，術(shù)中采集腫瘤組織及癌旁非腫瘤組織，在液氮中速凍后保存于超低溫冰箱中備用。人CRC細(xì)胞 SW620、SW480、LoVo 和 HCT116、人正常腸上皮細(xì)胞NCM460 均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%~90%融合時加入胰酶消化傳代。

1.1.2 主要試劑 TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）；ExoQuick外泌體分離試劑盒（北京博邁斯科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)circRNA分析 從GEO（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/geo/query/）數(shù) 據(jù) 庫 GSE126094獲取CRC組織和癌旁組織樣本的高通量測序數(shù)據(jù)。通過量化和背景校正，得到circRNA 在CRC 組織和癌旁組織表達(dá)值，篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2（Fold Change）|>1和調(diào)整后的P值<0.05。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期SW620 和SW480細(xì)胞，按照Lipofectamine3000 試劑轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染shRNA 陰性對照（sh-NC）、circRPPH1 shRNA（shcircRPPH1），48 h 后加入嘌呤霉素進(jìn)行陽性克隆篩選，穩(wěn)定培養(yǎng)后qRT-PCR檢測SW620和SW480細(xì)胞circRPPH1表達(dá)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 采用TRIzol 試劑提取組織樣本和細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，以 cDNA 為模板采用 SYBR Green 燃料法進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)，2?ΔΔCt計算 circRPPH1、miR-330-5p和NRAS mRNA相對表達(dá)。

1.2.4 MTT 檢測細(xì)胞增殖活性 將轉(zhuǎn)染后的SW620 和 SW480 細(xì)胞以 3 000 個/孔接種于 96 孔板，分別選取培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h 和 72 h 的細(xì)胞進(jìn)行增殖活性測定，20 μl/孔加入MTT 溶液（5 μg/ml）孵育4 h，輕輕吸取上層培養(yǎng)基，向培養(yǎng)孔中加入DMSO 150μl 充分溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀檢測490 nm 處吸光度，并繪制細(xì)胞生長曲線，各實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期 收集SW620 和 SW480 細(xì) 胞 ，加 入 200 μl 細(xì) 胞 液 離 心5 min，PBS 洗滌2 次，?20 ℃下用75%乙醇固定1 h，4 ℃下預(yù)冷，冰PBS 再次清洗細(xì)胞，按細(xì)胞周期試劑盒說明操作，將 Rnase A 溶液 20 μl 加入細(xì)胞，37 ℃水浴加熱30 min，加入PI 染料溶液400 μl 4 ℃避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測488 nm處細(xì)胞周期變化。

1.2.6 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：SW620 和SW480 細(xì)胞采用不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度為 1×106個/ml，取200 μl 細(xì)胞加入小室上室，將 600 μl 含 15%FBS 的培養(yǎng)基加入下室，37 ℃培養(yǎng)24 h，棉球輕輕擦去小室膜上表面未遷移細(xì)胞，甲醇固定30 min，0.2%結(jié)晶紫溶液染色30 min，顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取10 個視野進(jìn)行計數(shù)分析。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：先用Matrigel在小室上室聚碳酸酯膜上預(yù)涂一層基底膜，其他步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 外泌體提取與鑒定 分別取轉(zhuǎn)染Oe-circ-RPPH1 質(zhì)粒和sh-circRPPH1 及其對照質(zhì)粒的SW620 和 SW480 細(xì)胞，更換新鮮的含 10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收集上清，離心取出細(xì)胞碎片，ExoQuick 外泌體分離試劑盒提取細(xì)胞上清外泌體。透射電鏡觀察外泌體形態(tài)：取20μl外泌體懸液均勻涂布于電鏡銅網(wǎng)，室溫放置10 min，濾紙吸干液體，加入30μl 20 mg/ml磷鎢酸對外泌體樣品進(jìn)行室溫復(fù)染1 min，濾紙吸干液體，烤干，安裝銅網(wǎng)于樣品槽，透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)并拍照，將提取的細(xì)胞外泌體蛋白經(jīng)BCA 法蛋白定量，取20 μg樣品采用Western blot 檢測其標(biāo)志蛋白CD63、CD9表達(dá)。

1.2.8 細(xì)胞共培養(yǎng) 分別將轉(zhuǎn)染cy3-Oe-circ-RPPH1、cy3-Oe-NC、cy3-sh-circRPPH1、cy3-sh-NC 的SW620 和SW480 細(xì)胞作為供體細(xì)胞，未經(jīng)任何處理的SW620和SW480細(xì)胞作為受體細(xì)胞，提前將受體細(xì)胞以1×105個/孔接種于Transwell培養(yǎng)板基底外側(cè)室，培養(yǎng) 24 h 后收集供體細(xì)胞，1×105個/孔接種于Transwell培養(yǎng)板上室，補(bǔ)充培養(yǎng)基至300μl，共培養(yǎng)24 h 后分別收集供體細(xì)胞、細(xì)胞外泌體、受體細(xì)胞，qRT-PCR檢測細(xì)胞及外泌體中circRPPH1表達(dá)。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn) 分別將含有miR-330-5p 結(jié)合序列的circRPPH1 序列（circRPPH1 WT）及其突變序列（circRPPH1 MUT）、NRAS 的3'UTR 序 列（NRAS 3'UTR WT）及 其 突 變 序 列（NRAS 3'UTR MUT）構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，分別與 miRNA mimics（miR-NC）、miR-330-5p mimics（miR-330-5p）共轉(zhuǎn)染 SW620 和 SW480 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后分別收集各組細(xì)胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 circRPPH1 在CRC 組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)分析 GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）數(shù)據(jù)庫中CRC組織和癌旁非腫瘤組織的circRNA 高通量測序數(shù)據(jù)（GSE126094），通過量化和背景校正得到CRC組織和癌旁非腫瘤組織中circRNA表達(dá)，篩選出前5 位上調(diào)的circRNA 和前5 位下調(diào)的circRNA，繪制熱圖（圖1A），其中circRPPH1（hsa_circ_0000515）在CRC組織中高表達(dá)最為顯著（圖1B），經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，circRPPH1 在CRC 腫瘤組織中表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織（圖1C），在CRC細(xì)胞中表達(dá)顯著高于正常腸上皮細(xì)胞（圖1D）。進(jìn)一步分析circRPPH1在SW620 和SW480 細(xì)胞中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，細(xì)胞中circRPPH1 表達(dá)不受RNase R 外切酶影響（圖1E、F）。轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D 處理SW620和SW480 細(xì)胞，指定時間點(diǎn)分離總RNA，qRT-PCR檢測circRPPH1 和線性RPPH1 mRNA 表達(dá)，結(jié)果表明，SW620 和 SW480 細(xì)胞中，circRPPH1 半衰期超過24 h，而RPPH1 mRNA 半衰期約為3.5 h（圖1G、H）。證實(shí)circRPPH1 具有不受RNA 外切酶影響、不易降解、表達(dá)更穩(wěn)定的circRNA特性。

圖1 circRPPH1在CRC組織和細(xì)胞中的表達(dá)和驗(yàn)證Fig.1 Expression and validation of cirCRPPH1 in CRC tissues and cells

2.2 敲除circRPPH1 抑制CRC 細(xì)胞增殖活性 為探討circRPPH1 在CRC 中的生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建了敲低circRPPH1 表達(dá)的SW620 和SW480 細(xì)胞，qRT-PCR 檢測circRPPH1 敲低轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，與 sh-NC 組比較，sh-circRPPH1 組 SW620 和 SW480細(xì)胞circRPPH1 表達(dá)明顯降低，提示轉(zhuǎn)染成功（圖2A）。MTT 結(jié)果顯示，與sh-NC 組比較，sh-circ-RPPH1 組SW620 和SW480 細(xì)胞增殖活性明顯降低（圖2B、C），提示敲除circRPPH1 能夠抑制CRC 細(xì)胞增殖活性。

圖2 敲除circRPPH1抑制CRC細(xì)胞增殖活性Fig.2 circRPPH1 knockout inhibited proliferation activity of CRC cells

2.3 敲除circRPPH1 阻滯CRC 細(xì)胞的增殖周期進(jìn)展 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖周期，結(jié)果顯示，與sh-NC 組比較，sh-circRPPH1 組 SW620 和 SW480 細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比明顯提高，而S 期細(xì)胞百分比明顯降低，說明敲除circRPPH1 可阻滯細(xì)胞于G0/G1期，阻滯細(xì)胞向S期進(jìn)展，從而抑制細(xì)胞增殖（圖3）。

圖3 敲除circRPPH1阻滯CRC細(xì)胞增殖周期進(jìn)展Fig.3 circRPPH1 knockout blocked proliferation cycle progression of CRC cells

2.4 敲除circRPPH1 抑制CRC 細(xì)胞的遷移和侵襲 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，與 sh-NC 組比較，sh-circRPPH1 組 SW620和SW480 細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯減少，說明敲低circRPPH1可抑制CRC細(xì)胞遷移和侵襲（圖4）。

圖4 敲除circRPPH1抑制CRC細(xì)胞遷移和侵襲Fig.4 Knockout of circRPPH1 inhibited migration and invasion of CRC cells

2.5 CRC 細(xì)胞通過外泌體將circRPPH1 傳遞給周圍癌細(xì)胞 本研究進(jìn)一步探討了CRC 細(xì)胞對周圍細(xì)胞的影響機(jī)制，ExoQuick 外泌體分離試劑盒分離收集CRC 細(xì)胞分泌的外泌體，透射電鏡觀察到外泌體呈圓形或卵圓形的囊泡結(jié)構(gòu)，直徑為30~100 nm（圖5A）；Western blot 結(jié)果表明，外泌體標(biāo)志蛋白呈陽性表達(dá)（圖5B）。證實(shí)外泌體分離成功。qRTPCR 檢測供體細(xì)胞及其外泌體、受體細(xì)胞circ-RPPH1 表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染OecircRPPH1 質(zhì)粒的 SW620 和 SW480 供體細(xì)胞、細(xì)胞外泌體和受體細(xì)胞circRPPH1 表達(dá)均明顯升高，而轉(zhuǎn)染 sh-circRPPH1 質(zhì)粒的 SW620 和 SW480 供體細(xì)胞、細(xì)胞外泌體和受體細(xì)胞circRPPH1 表達(dá)均明顯降低（圖5C~E）。說明SW620 和SW480 細(xì)胞可通過外泌體將circRPPH1傳遞給周圍癌細(xì)胞。

圖5 CRC細(xì)胞通過外泌體將circRPPH1傳遞給周圍癌細(xì)胞Fig.5 CRC cells deliver circRPPH1 to surrounding can?cer cells via exosomes

2.6 circRPPH1 在 CRC 細(xì)胞中起 miR-330-5p 海綿作用 為進(jìn)一步研究circRPPH1在CRC細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，利用在線生物學(xué)數(shù)據(jù)庫starBase 和CircIn?teractome 預(yù)測與 circRPPH1 相關(guān)的 miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circRPPH1 與miR-330-5p 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖6A）。雙熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗(yàn)表明circRPPH1 與miR-330-5p 可相互結(jié)合（圖6B、C）。qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，miR-330-5p 在CRC 組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)（圖6D、E）。

圖6 circRPPH1靶向調(diào)節(jié)miR-330-5pFig.6 circRPPH1 targeting regulated miR-330-5p

2.7 NRAS 是miR-330-5p 的下游靶基因 進(jìn)一步采用 starBase、miRDB 和 miRWalk 數(shù)據(jù)庫預(yù)測 miR-330-5p的潛在下游靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-330-5p與NRAS 的3'UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖7A）；雙熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗(yàn)表明miR-330-5p能夠與NRAS的3'UTR 相互結(jié)合（圖 7B、C）。TCGA（http：//gepia.cancer-pku. cn/detail. php）數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，NRAS在CRC 腫瘤組織中呈高表達(dá)（圖7D）。qRT-PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證NRAS在CRC腫瘤組織和癌細(xì)胞均呈高表達(dá)（圖7E、F）。

圖7 miR-330-5p與NRAS的相互作用Fig.7 Interaction between miR-330-5p and NRAS

3 討論

近年隨著我國居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)（高脂肪、高蛋白、低纖維素飲食）改變及人口老齡化加劇，CRC 發(fā)病率一直居高不下。我國腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示，2015 年預(yù)計新發(fā)病例約37.6 萬例，在同年總新發(fā)腫瘤中位列第五，病死病例約19.1 萬例，同樣位居總死亡腫瘤病例第五［11］。早期發(fā)現(xiàn)、診斷并及時治療可顯著降低CRC 患者病死率，但現(xiàn)階段CRC 早期診斷方法有限，疾病一旦進(jìn)展則治療手段仍以傳統(tǒng)手術(shù)加輔助化療為主，且療效并不理想［12-13］。導(dǎo)致這一困境的重要原因是目前CRC 發(fā)病機(jī)制尚未闡明。因此，為提升CRC 的早期診治率，同時讓中晚期患者獲得長期生存希望，深入研究并揭示CRC發(fā)病機(jī)制顯得十分重要。

circRNA 是一類具有調(diào)節(jié)能力的內(nèi)源性非編碼RNA，通過反向剪接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使其不易受RNA 外切酶影響，具有細(xì)胞外穩(wěn)定性和進(jìn)化保守性，在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用［14］。circRNA的功能多種多樣，除能夠發(fā)揮miRNA 海綿功能，調(diào)節(jié)親本基因組間轉(zhuǎn)錄、干預(yù)剪接及與RNA 結(jié)合蛋白相互作用外，部分circRNA 還能通過自身編碼蛋白參與基因表達(dá)調(diào)控［15-16］。近年研究顯示，circRNA 與多種疾病發(fā)生有關(guān)，具有成為疾病診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力［17］。

多項(xiàng)研究表明，多種circRNA 在CRC 中異常表達(dá)，可能成為調(diào)控CRC 進(jìn)展的重要靶點(diǎn)。如PEI等［18］研究表明，circ_0000218 在 CRC 組織和細(xì)胞中明顯上調(diào)，其高表達(dá)與CRC的TNM分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且circ_0000218 可通過miR-139-3p/RAB1A 軸調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。YANG等［19］研究表明，circ_0137008 在 CRC 組織和細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)circ_0137008能夠抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。YAN 等［20］研究發(fā)現(xiàn) circHIPK3 可作為miR-1207-5p 海綿促進(jìn)其下游癌基因FMNL2 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。 circRPPH1（circ_0000515）已被報道在宮頸癌中高表達(dá)，發(fā)揮促癌作用。但其在CRC 中的作用尚不清楚。本研究通過分析數(shù)據(jù)庫結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)circRPPH1 在CRC組織和癌細(xì)胞中也呈高表達(dá)，提示circRPPH1 可能是CRC 的潛在生物標(biāo)志物。通過細(xì)胞增殖、周期、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，敲除circRPPH1 能夠抑制CRC 細(xì)胞增殖活性，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，并抑制細(xì)胞遷移和侵襲，證實(shí)circRPPH1 表達(dá)與CRC 進(jìn)展有關(guān)。

細(xì)胞分泌的外泌體可通過傳遞其內(nèi)含物（如蛋白、miRNA、circRNA）作為細(xì)胞間通訊媒介，在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病診斷和治療中起重要作用［21-22］。目前，有關(guān)CRC 外泌體的報道主要集中于miRNA，外泌體circRNA 在CRC 中的研究較少。本研究分離提取CRC 細(xì)胞外泌體，并通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CRC 細(xì)胞可通過分泌外泌體將circRPPH1 傳遞給周圍癌細(xì)胞，而高表達(dá)的circRPPH1 在CRC 中發(fā)揮促癌作用，提示外泌體circRPPH1 可能是CRC潛在的生物標(biāo)志物。

功能研究表明，circRNA 分子富含miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，可通過海綿miRNA 正向調(diào)控其下游靶基因表達(dá)，參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，這一作用機(jī)制被稱為競爭性內(nèi)源RNA機(jī)制［23-24］。本研究利用在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對circRPPH1 相關(guān)的miRNA 及其下游靶基因進(jìn)行預(yù)測，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示circRPPH1可在miR-330-5p中發(fā)揮海綿作用，而NRAS 是miR-330-5p的下游靶基因，提示靶向調(diào)控miR-330-5p/NRAS 表達(dá)可能是circRPPH1 發(fā)揮生物學(xué)功能的潛在分子機(jī)制。

綜上所述，本研究明確了circRPPH1 在CRC 中的生物學(xué)功能及潛在調(diào)控機(jī)制，并證實(shí)circRPPH1可通過外泌體在CRC 細(xì)胞間傳遞，提示外泌體circ RPPH1可能作為潛在生物標(biāo)志物促進(jìn)CRC進(jìn)展。