IL-37 通過調控LINC01554/miR-223-3p 軸抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲

韓森吉 李 媛 李 振 王 毅② （山東省淄博市第一醫(yī)院產(chǎn)科，淄博 255200）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康。由于卵巢體積較小，且卵巢癌發(fā)病時缺乏典型癥狀，早期難以發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已處于中晚期［1］。因此，深入探究卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制并尋找早期生物標志物和分子治療靶點尤為重要。研究表明，炎癥性微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［2］。IL-37 是 IL-1 家族中的抗炎因子，是先天免疫應答和獲得性免疫應答的抑制劑。近年IL-37 的抗腫瘤活性逐漸被發(fā)現(xiàn)。研究顯示，IL-37 可抑制肝細胞癌、宮頸癌等腫瘤細胞增殖和遷移等惡性表型［3-4］。但IL-37 對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的作用尚未闡明。

LINC01554 屬于長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），其在肝細胞癌中表達降低，過表達LINC01554 可抑制肝細胞癌細胞生長、集落形成和體內腫瘤形成，為肝細胞癌治療提供了新的分子靶點［5］。但LINC01554 對卵巢癌細胞惡性表型的影響及調控機制尚未闡明。lncRNA 可作為競爭性內源性RNA 與miRNA 靶向結合，調控miRNA 靶基因表達，從而發(fā)揮生物學功能［6］。LncBase v.2 生物信息學軟件預測顯示，LINC01554 可能靶向結合miR-223-3p。有報道稱miR-223-3p在卵巢癌組織中表達上調，過表達miR-223-3p 可靶向抑制SOX11 表達促進體外卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲及體內腫瘤生長，miR-223-3p 可能是卵巢癌治療的潛在分子靶點［7］。因此，本研究以卵巢癌細胞Caov-3 為研究對象，以LINC01554/miR-223-3p 軸為切入點，觀察了IL-37 對Caov-3 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 取 2017 年 10 月至 2019 年 5 月于山東省淄博市第一醫(yī)院行手術治療的33 例卵巢癌患者的卵巢癌組織及癌旁正常組織，平均年齡（53.26±7.58）歲。納入標準：①首次確診；②術前未接受放療、化療等治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤患者；②合并高血壓、糖尿病等慢性病患者；③合并血液系統(tǒng)疾病患者。本研究經(jīng)山東省淄博市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（201709-0206），患者知情同意。

1.1.2 細胞和試劑 卵巢癌細胞株Caov-3（中國科學院上海細胞庫）；IL-37（美國Sigma 公司）；胎牛血清（FBS，美國 Hycolne 公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基、CCK-8 試劑盒（北京索萊寶）；Trizol 試劑和Lipo?fectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；PCR引物、LINC01554 過表達載體（pcDNA-LINC01554，5'-ATGTCATCGTGCGCGACACG-3'）、空載體（pcDNA，5'-CTGCGCGATATTCGTCTACG-3'）、LINC01554 小干擾RNA（si-LINC01554，5'-CGGAATTCATATCGC?TACG-3'）、亂序無意義陰性序列（si-NC，5'-CGG?TATGCCGATAGCGTAC-3'）、miR-223-3p 模 擬 物（mimics，5'-GUUAGGCUCGAUGUCUAUG-3'）、模擬對 照 序 列（miR-NC，5'-GCUCGUUAUAGCGUUA?CUC-3'）由上海生工生物工程有限公司提供；二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒（上海碧云天）；神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cad?herin）、上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）和 GAPDH 抗體（武漢博士德）；逆轉錄試劑盒、PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR 檢測組織中LINC01554 和miR-223-3p 表達 在液氮保護下，研磨收集的卵巢癌組織和癌旁正常組織，加入Trizol 試劑提取總RNA，逆轉錄為 cDNA，行 PCR 反應。PCR 反應條件：95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 個循環(huán)。引物序列：LINC01554 正向引物5'-TGTG?GCAAACGCAAACGA-3'，反向引物 5'-GCCCAGAG?TAAAGGGAAATGTA-3'；miR-223-3p 正 向 引 物 5'-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3'，反向引物 5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；GAPDH 正向引物5'-TG?GTATCGTGGAAGGACT-3'，反向引物5'-AGTAGA-GGCAGGGATGATG-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTC?GGCAGCACA-3'，反向引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2?ΔΔCt計算 LINC01554 和 miR-223-3p相對表達，其中LINC01554 以GAPDH 為內參，miR-223-3p以U6為內參。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 采用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)Caov-3 細胞，當細胞生長至80%左右密度時0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3 比例傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期Caov-3細胞以5×105個/孔接種于6孔板，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書 分 別 轉 染 pcDNA、pcDNA-LINC01554、si-NC、si-LINC01554、miR-NC、miR-223-3p mimics 6 h，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后RT-qPCR 檢測細胞LINC01554或miR-223-3p 表達驗證轉染效率，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組處理 未轉染的Caov-3 細胞分為不同劑量IL-37 組，分別采用含 0、10、50、100 ng/ml IL-37 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h［3］。轉染 pcDNA、pcDNALINC01554 的Caov-3 細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為 pcDNA 組、pcDNA-LINC01554 組。轉染 si-NC、si-LINC01554、miR-NC、miR-223-3p mimics 的Caov-3細胞均用含100 ng/ml IL-37 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別 記 為 IL-37+si-NC 組 、IL-37+si-LINC01554 組 、IL-37+miR-NC組和IL-37+miR-223-3p組。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖 將未轉染、轉染后的Caov-3 細胞均以 0.5×104個/孔接種于 96 孔板，按1.2.3 分組。培養(yǎng) 24 h 后加入 10 μl CCK-8 試劑孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處光密度（OD）值。

1.2.5 克隆形成實驗 將未轉染、轉染后的Caov-3細胞均以500 個/皿接種于培養(yǎng)皿，按1.2.3 分組。培養(yǎng)2 周后，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定25 min，0.1%結晶紫染色15 min，顯微鏡觀察，統(tǒng)計超過50個細胞的集落。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 將未轉染、轉染后的 Caov-3 細胞均以 5×104個/孔接種于 6 孔板，培養(yǎng)4 h，細胞貼壁后，用200μl 移液器槍頭在培養(yǎng)板底部沿中軸劃兩條平行線。PBS 洗掉劃痕間細胞，并測量劃痕間距d，記為d0h。按1.2.3 分組，培養(yǎng)24 h 后再次測量細胞間間距d，記為d24h，計算劃痕愈合率（%）=（d0h?d24h）/d0h×100%。

1.2.7 Transwell 檢測細胞侵襲 將未轉染、轉染后的 Caov-3 細胞均以 5×105個/孔接種于 6 孔板，按1.2.2 分組。培養(yǎng)24 h 后，收集細胞，調整濃度為5×104個/ml 的細胞懸液。將 Transwell 小室置于24 孔板，上室鋪設Matrigel 基質膠，自然晾干，加入100 μl 細胞懸液，下室加 500 μl 培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基。取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色15 min，顯微鏡觀察，隨機取5個視野拍照并計數(shù)。

1.2.8 Western blot 檢測細胞 E-cadherin 和 N-cad?herin 蛋白表達 將未轉染、轉染后的Caov-3 細胞均以5.0×105個/孔接種于6孔板，按1.2.3分組。培養(yǎng)24 h 后收集細胞，RIPA 試劑提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，行SDS-PAGE 電泳，濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）和 GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔二抗（1∶3 000）37 ℃孵育1 h，加入化學發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH 為內參，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因實驗 將對數(shù)生長期Caov-3 細胞以 5×105個/孔接種于 6 孔板，參照 Lipo?fectamineTM2000 試劑盒說明書分別共轉染W(wǎng)TLINC01554 與 miR-NC 或 miR-223-3p mimics、MUTLINC01554 與 miR-NC 或 miR-223-3p mimics。轉 染6 h后收集細胞并裂解，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。Pearson 相關性分析分析卵巢癌組織中LINC01554與miR-223-3p表達的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC01554 和miR-223-3p 在卵巢癌中的表達及相關系分析 卵巢癌組織中LINC01554表達低于癌旁正常組織（P<0.05），而miR-223-3p 表達高于癌旁組織（P<0.05）。Pearson相關性分析顯示，卵巢癌組織中LINC01554 與miR-223-3p 表達呈負相關（r=?0.977 2，P<0.05，圖1）。

圖1 卵巢癌組織LINC01554和miR-223-3p表達及相關性Fig.1 Expressions and correlation of LINC01554 and miR-223-3p in ovarian cancer tissue

2.2 IL-37 對Caov-3 細胞增殖、遷移和侵襲的影響 Caov-3 細胞經(jīng) 50、100 ng/ml IL-37 干預后，細胞中LINC01554 表達升高（P<0.05），而miR-223-3p 表達降低（P<0.05），細胞OD值和集落形成數(shù)降低（P<0.05），劃痕愈合率降低（P<0.05），侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），E-cadherin 蛋白表達升高（P<0.05），而N-cadherin蛋白表達降低（P<0.05，圖2、表1）。

表1 IL-37對Caov-3細胞LINC01554和miR-223-3p表達及增殖的影響（）Tab.1 Effect of IL-37 on expressions of LINC01554 and miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

表1 IL-37對Caov-3細胞LINC01554和miR-223-3p表達及增殖的影響（）Tab.1 Effect of IL-37 on expressions of LINC01554 and miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

Note：Compared with IL-37 0 ng/ml group，1）P<0.05；compared with IL-37 10 ng/ml group，2）P<0.05；compared with IL-37 50 ng/ml group，3）P<0.05.

Colony forming number 106.67±3.30 107.33±4.50 84.33±3.401）2）54.67±2.051）2）3）157.461 0.000 Groups IL-37 0 ng/ml IL-37 10 ng/ml IL-37 50 ng/ml IL-37 100 ng/ml F P LINC01554 1.00±0.00 1.03±0.04 1.67±0.061）2）3.62±0.191）2）3）441.511 0.000 miR-223-3p 1.00±0.00 0.97±0.03 0.56±0.061）2）0.12±0.011）2）3）446.326 0.000 OD value 1.17±0.08 1.18±0.08 0.94±0.071）2）0.64±0.041）2）3）40.057 0.000

圖2 IL-37 對 Caov-3 細 胞 遷 移 、侵 襲 及 E-cadherin 和N-cadherin蛋白表達的影響Fig.2 Effect of IL-37 on migration and invasion and expressions of E-cadherin and N-cadherin proteins of Caov-3 cells

2.3 過表達LINC01554對Caov-3細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與pcDNA 組相比，pcDNA-LINC01554組 Caov-3 細胞 LINC01554 表達升高（P<0.05），而miR-223-3p 表達降低（P<0.05），細胞 OD 值和集落形成數(shù)降低（P<0.05），劃痕愈合率降低（P<0.05），侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），E-cadherin 蛋白表達升高（P<0.05），而N-cadherin 蛋白表達降低（P<0.05，圖3、表2）。

表2 過表達 LINC01554 對 Caov-3 細胞 miR-223-3p 表達及增殖的影響（）Tab.2 Effect of overexpression of LINC01554 on expres?sion of miR-223-3p and proliferation of Caov-3 cells（）

表2 過表達 LINC01554 對 Caov-3 細胞 miR-223-3p 表達及增殖的影響（）Tab.2 Effect of overexpression of LINC01554 on expres?sion of miR-223-3p and proliferation of Caov-3 cells（）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05.

Groups pcDNA pcDNALINC01554 LINC01554 1.00±0.00 4.13±0.141）miR-223-3p 1.00±0.00 0.19±0.021）OD value 1.18±0.09 0.59±0.031）Colony forming number 106.33±4.78 45.67±2.051）20.201 0.000 t P 38.724 0.000 70.148 0.000 10.772 0.000

圖3 過表達 LINC01554 對 Caov-3 細胞遷移、侵襲及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響Fig.3 Effect of overexpression of LINC01554 on migra?tion and invasion and protein expressions of E-cad?herin and N-cadherin in Caov-3 cells

2.4 敲減LINC01554可減輕IL-37對Caov-3細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與IL-37+si-NC 組相比，IL-37+si-LINC01554 組 Caov-3 細 胞 LINC01554 表 達降低（P<0.05），而miR-223-3p 表達升高（P<0.05），細胞OD 值和集落形成數(shù)升高（P<0.05），劃痕愈合率升高（P<0.05），侵襲細胞數(shù)增多（P<0.05），E-cadherin蛋白表達降低（P<0.05），而N-cadherin蛋白表達升高（P<0.05，圖4、表3）。

表3 敲減LINC01554減輕IL-37對Caov-3細胞miR-223-3p表達及增殖的影響（）Tab.3 Knockdown of LINC01554 reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

表3 敲減LINC01554減輕IL-37對Caov-3細胞miR-223-3p表達及增殖的影響（）Tab.3 Knockdown of LINC01554 reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and proliferation in Caov-3 cells（）

Note：Compared with IL-37+si-NC group，1）P<0.05.

Groups LINC01554miR-223-3p OD value IL-37+si-NC IL-37+si-LINC01554 3.53±0.24 1.17±0.071）0.11±0.01 0.82±0.071）0.65±0.04 1.08±0.091）Colony forming number 55.00±1.63 94.33±3.861）16.258 0.000 t P 16.351 0.000 17.391 0.000 7.562 0.002

圖4 敲減LINC01554 減輕IL-37 對Caov-3 細胞遷移、侵襲及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響Fig.4 Knockdown of LINC01554 reduces effects of IL-37 on migration and invasion and protein expressions of E-cadherin and N-cadherin in Caov-3 cells

2.5 LINC01554 靶向結合miR-223-3p LncBase v. 2 生物信息學軟件預測顯示，LINC01554 與miR-223-3p 的核苷酸序列存在連續(xù)結合位點（圖5）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，共轉染W(wǎng)TLINC01554 與miR-223-3p mimics 的細胞熒光素酶活性低于共轉染W(wǎng)T-LINC01554 與miR-NC 的細胞（0.15±0.01vs0.96±0.08，t=17.402，P<0.05），而共轉染 MUT-LINC01554 與 miR-223-3p mimics 的細胞熒光素酶活性與共轉染MUT-LINC01554 與miR-NC的細胞差異無統(tǒng)計學意義（0.95±0.07vs0.99±0.08，t=0.652，P=0.550），說明LINC01554可靶向結合miR-223-3p。

圖5 LINC01554和miR-223-3p的互補序列Fig.5 Complementary sequences between LINC01554 and miR-223-3p

2.6 過表 達 miR-223-3p 減 弱 IL-37 對 Caov-3 細 胞增殖、遷移和侵襲的影響 與IL-37+miR-NC 組比較，IL-37+miR-223-3p 組 Caov-3 細胞 miR-223-3p 表達升高（P<0.05），細胞OD值和集落形成數(shù)升高（P<0.05），劃痕愈合率升高（P<0.05），侵襲細胞數(shù)增多（P<0.05），E-cadherin 蛋白表達降低（P<0.05），而N-cadherin蛋白表達升高（P<0.05，圖6、表4）。

圖6 過表達miR-223-3p 減弱IL-37 對Caov-3 細胞遷移、侵襲及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響Fig.6 Overexpression of miR-223-3p reduces effects of IL-37 on migration and invasion and protein expressions of E-cadherin and N-cadherin in Caov-3 cells

表4 過表達miR-223-3p 減弱IL-37 對Caov-3 細胞miR-223-3p表達及增殖的影響（）Tab.4 Overexpression of miR-223-3p reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and prolifera?tion in Caov-3 cells（）

表4 過表達miR-223-3p 減弱IL-37 對Caov-3 細胞miR-223-3p表達及增殖的影響（）Tab.4 Overexpression of miR-223-3p reduces effect of IL-37 on expression of miR-223-3p and prolifera?tion in Caov-3 cells（）

Note：Compared with IL-37+miR-NC group，1）P<0.05.

Colony forming number 54.67±2.05 86.67±3.861）12.681 0.000 IL-37+miR-NC IL-37+miR-223-3p t P 0.12±0.01 0.76±0.051）21.740 0.000 0.64±0.05 0.90±0.061）5.766 0.004 Groups miR-223-3p OD value

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，IL-37 具有抗腫瘤作用。IL-37可能通過下調p-STAT3 和MMP-2 表達抑制肝癌細胞 SMMC-7721 增殖、侵襲和遷移［8］；IL-37 可能通過抑制IL-6/STAT3 信號通路抑制食管癌細胞增殖、遷移及炎癥反應［9］；高表達IL-37可抑制宮頸癌細胞增殖，并增強宮頸癌細胞對順鉑的敏感性，其作用機制與下調 STAT3 和 CyclinD1 表達有關［10］。本研究顯示，卵巢癌細胞經(jīng)IL-37 干預后增殖、遷移和侵襲能力降低，提示IL-37 也發(fā)揮抗卵巢癌作用，但其機制還需深入探究。

腫瘤細胞遷移和侵襲是其復發(fā)和轉移的主要原因，抑制腫瘤細胞遷移和侵襲可有效降低腫瘤復發(fā)和轉移的概率［11］。上皮-間質轉化（epithelial-mes?enchymal transformation，EMT）是細胞失去上皮極性而獲得間質細胞特性的過程，此過程中上皮標志物E-cadherin 表達降低，而間質標志物N-cadherin 表達升高［12］。腫瘤細胞經(jīng)歷EMT 后，其骨架發(fā)生改變，細胞間黏附作用降低，易于遷移，形成轉移灶［13］。本研究顯示，IL-37 可促進卵巢癌細胞中E-cadherin蛋白表達而抑制N-cadherin 蛋白表達，提示IL-37 可能通過抑制卵巢癌細胞EMT抑制細胞遷移和侵襲。

lncRNA 和miRNA 是兩類參與調控腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移等惡性表型的小分子非編碼RNA，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用［14］。LI 等［15］和DING 等［16］研究顯示，LINC01554 在肝細胞癌中表達降低，與患者TNM 分期、腫瘤復發(fā)率及總生存期密切相關，過表達LINC01554 可抑制肝細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進腫瘤細胞周期阻滯，是肝癌診斷和預后判斷的生物標志物。本研究顯示，過表達LINC01554 可減弱卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，提示LINC01554 也可作為卵巢癌靶向治療的分子靶點。本研究還顯示，IL-37可促進卵巢癌細胞LINC01554 表達，而敲減 LINC01554 則減弱 IL-37 對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示IL-37 可能通過上調LINC01554 表達抑制卵巢癌細胞惡性表型。

為進一步探究IL-37 可能通過上調LINC01554抑制卵巢癌細胞惡性表型的分子機制，本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實LINC01554可靶向結合miR-223-3p，且過表達LINC01554 促進卵巢癌細胞miR-223-3p 表達，說明LINC01554 靶向結合并負調控miR-223-3p。研究顯示，miR-223-3p 在非小細胞肺癌、胃癌和腎細胞癌等腫瘤中表達上調，發(fā)揮促癌基因作用［17-19］。本研究顯示，IL-37 可抑制卵巢癌細胞中miR-223-3p 表達，而過表達miR-223-3p 減輕IL-37 對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進一步提示IL-37可能通過靶向LINC01554進而抑制miR-223-3p表達影響卵巢癌細胞惡性表型。

綜上，IL-37 可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與調控LINC01554/miR-223-3p軸有關。但本研究存在不足之處，僅通過體外單一細胞實驗探究了IL-37 對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及可能機制，尚未進行裸鼠移植瘤實驗在體內驗證IL-37 對卵巢癌發(fā)生和轉移的影響，且LINC01554/miR-223-3p軸下游靶基因和信號通路對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響也未涉及，因此還需進一步探究。