Tet1對海分枝桿菌感染過程中宿主炎癥反應及肥大細胞活化的影響①

丁才榮 韓珊珊 張 丁 聞 馨 宋璟瑞 杜德兵 李 丹 王德成

（三峽大學醫學院，三峽大學感染與炎癥損傷研究所，宜昌 443002）

結 核 分 枝 桿 菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是造成人或動物結核病（tuberculosis，TB）的病原體［1］，其傳染性和致病性強，相關研究需在生物安全3 級實驗室操作，導致MTB-宿主相互作用的研究及其進展緩慢［2］。海分枝桿菌（Mycobacterium marinum，Mm）是一種機會致病菌，與MTB的遺傳背景最為相似，在天然宿主如斑馬魚體內可產生類似干酪樣肉芽腫的典型病變［3-4］；且CARLSSON 等［5］研究證實，Mm可通過小鼠尾靜脈建立感染并形成肉芽腫樣病變。Mm可入侵巨噬細胞，阻止吞噬體-溶酶體融合，并在巨噬細胞內潛伏增殖，感染了Mm的巨噬細胞在TNF-α 誘導產生的線粒體活性氧（ROS）和親環蛋白D 的參與下觸發受感染細胞的程序性壞死，致使細菌大量擴散增殖［6-7］。此外，Mm和MTB產生毒力均需ESX-1 分泌系統的參與，二者具有共同的毒力途徑，諸多優點使Mm越來越多地應用于分枝桿菌致病機制的研究［8-10］。

Tet1（tet methylcytosine dioxygenase 1）是一種依賴Fe2+和α-酮戊二酸的雙加氧酶，可將5-甲基胞嘧啶（5-mC）轉化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）以調節多種表觀遺傳反應［11］。研究發現，Tet1在腫瘤、發育、細胞增殖和感染等多種病理生理過程中發揮重要作用［12］。幽門螺桿菌既能通過谷氨酰轉移酶上調Tet1表達以活化Wnt 信號通路，也能通過毒力島CagA 調控Tet1介導的DNA 甲基化導致KLF4 失活，最終促進胃癌的發生發展［13-14］。前期通過Mm的Tet1-/-小鼠尾靜脈感染模型發現，Tet1-/-小鼠既能顯著降低菌載量，又能有序控制組織病理損傷，但Tet1如何“平衡”免疫應答與組織損傷的內在機制尚不明確［15］。肥大細胞（mast cells，MCs）是重要的免疫細胞，主要分布于與外界環境相通的組織中［16］。CARLOS 等［17］通過H37Rv 的小鼠感染模型發現MCs可通過分泌細胞因子發揮抗結核免疫反應。雖然已有文獻表明MCs 的活化對抗分枝桿菌感染至關重要，但細菌感染過程中MCs 活化的調控及其機制尚需深入研究。綜合已有的關于Tet1的研究報道，本研究擬通過建立Mm的Tet1基因敲除小鼠尾靜脈感染模型，初步探究Mm感染過程中MCs的活化，明確Tet1調控MCs活化對宿主抗菌免疫的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與菌株 SPF 級野生型C57BL/6 小鼠購自三峽大學實驗動物中心，SPF 級C57BL/6 背景的Tet1+/-小鼠由中國科學院水生生物研究所肖武漢研究員課題組提供［18］。Tet1+/-與野生型C57BL/6 雜交后，將鑒定的Tet1+/-小鼠進行雌雄配對，獲得Tet1+/+與Tet1基因全身敲除小鼠（Tet1-/-）。所有小鼠飼養于M1型小鼠飼養籠，溫度20～24 ℃，濕度55%～65%，光照（12 h 明暗交替），食用小鼠標準顆粒飼料和純凈水。自由飲水和攝食，并定期更換墊料。Mm由華盛頓大學LALITA RAMAKRISHNAN 教授饋贈，由本課題組保種傳代［19］。

1.1.2 主要試劑與儀器 Triton-X、牛血清白蛋白（BSA）、DEPC水、甲苯胺藍試劑盒購自索萊寶公司；吐溫-80、20×PBS 緩沖液、4%多聚甲醛組織固定液購自上海生物工程有限公司；Middlebrook 7H9 細菌液體培養基、OADC 細菌營養液購自BD 公司；抗酸染色試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；抗肥大細胞類胰蛋白酶（Tryptase）一抗（ab2378）購自Abcam 公司；5 羥色胺（5-HT）兔抗鼠單克隆抗體購自博士德生物工程有限公司；電動組織研磨器購自天根生化科技有限公司。透射電子顯微鏡HT-7500購 自HITACHI 公 司；Olympus 顯 微 鏡（Olympus BX63）及Cellsens 圖像分析系統購自Olympus 公司；Multiskan Spectrum 全波長酶標儀購自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1Mm的培養與處理方法

1.2.1.1 細菌復蘇 將保種于-80 ℃冰箱中的Mm于室溫解凍，取適當菌液（體積視菌濃度而定）于含10%OADC 的7H9 細菌液體培養基中，置于32 ℃、100 r/min的搖床中避光培養7～9 d，直至對數生長期（OD600=0.6～1.0）。

1.2.1.2 單細菌制備 當Mm生長至對數生長期時，取出菌液于50 ml 離心管中，4 000 r/min 離心20 min，棄上清，加入1 ml 含10%OADC 的7H9 細菌液體培養基，振蕩混勻，隨后吸取200 μl細菌重懸液分裝至1.5 ml無菌EP管中，再加入1 ml 7H9液體培養基，然后使用1 ml 注射器來回吹散細菌（15～20 次），100 g 離心1 min，細菌懸液用5 μm 濾膜過濾后分裝至1 ml凍存管，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.1.3 細菌處理 實驗前從-80 ℃冰箱中取出單細菌菌液，在4 ℃冰箱解凍后10 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入無菌PBS 溶液重懸細菌，通過測定細菌重懸液的OD 值換算出需要注射給小鼠的菌液體積。

1.2.2 構建小鼠Mm尾靜脈感染模型 SPF 級雌性Tet1+/+小鼠及Tet1-/-小鼠各30只，預飼養7 d后，將兩種小鼠隨機分為空白對照組（8 只）和Mm感染組（22 只）。在無菌條件下尾靜脈注射100 μlMm菌液，每只小鼠尾部注射菌量均為3×107CFU，空白對照組小鼠注射等體積的PBS溶液。每天固定時間觀察拍照小鼠尾組織病變情況，并測量小鼠尾部病變面積。感染第20 天時，頸椎脫臼法處死各組小鼠，收集小鼠尾巴進行后續實驗研究。

1.2.3 尾組織載菌量檢測 取小鼠尾組織病變部位，PBS 溶液漂洗，使用電動勻漿器在含0.1% Triton-X（1×Triton-X 原液經無菌PBS 稀釋）的無菌PBS溶液中將組織勻漿后，將組織懸液用PBS 連續倍比稀釋并均勻涂在含10%OADC 的7H10 固體培養平板上，置于32 ℃培養箱避光培養8～10 d，計單個菌落數，小鼠尾組織菌載量表示為CFU/g組織。

1.2.4 HE 染色 將小鼠組織置于4%多聚甲醛固定液，4 ℃放置6～24 h，隨后將組織轉移至75%乙醇，進行組織修塊；修好的組織按照以下乙醇濃度進行梯度脫水：70%乙醇30 min、80%乙醇1 h、90%乙醇1 h、95%乙醇1.5 h、無水乙醇Ⅰ30 min、無水乙醇Ⅱ30 min 至完全脫水；隨后依次置于二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min進行透明；完成脫水的組織經石蠟處理后，將組織塊置于熔點為60 ℃的石蠟中包埋；切片機將蠟塊切成約4 μm 厚的連續切片，置于37 ℃烘箱中6～8 h，后續常溫避光保存備用。制備好的切片按照下列順序脫蠟：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇各浸入10 min，隨后浸入80%乙醇5 min、70%乙醇5 min，然后浸置于蒸餾水中；蘇木精復染3 min，流水沖洗30 min，伊紅染色2 min，鹽酸乙醇分化，常規梯度乙醇脫水至透明；切片自然風干，中性樹脂封片。

1.2.5 抗酸染色 切片脫蠟參照HE 染色步驟。將已固定的切片滴加石碳酸復紅溶液染色5 min，蒸餾水沖洗脫色后，亞甲基藍溶液復染30 s，常規梯度乙醇脫水至透明，自然風干后封片。

1.2.6 甲苯胺藍染色 將石蠟切片浸入二甲苯2 次，15 min/次，不同濃度的乙醇各浸沒1 min，流水沖洗2～3 min；Toluidine Blue O Stain 中浸染30 min，流水沖洗2～3 min，用濾紙吸干水分或直接晾干；95%乙醇分色至背景呈淡藍色，在鏡下控制分色效果；再用無水乙醇脫水1 min，二甲苯透明2 次，每次2 min，中性樹膠封固。MC 顆粒呈紅紫色，胞核呈藍色。

1.2.7 免疫組織化學染色 切片脫蠟參照HE 染色步驟。將切片置于修復盒，加入檸檬酸鹽緩沖溶液，液面要浸沒組織，沸水浴20 min 修復后取出，冷卻至室溫，PBS 潤洗2 min；將3%的過氧化氫滴于組織片，室溫放置15 min，PBS 沖洗2 min，5%BSA 37 ℃封閉15 min；甩掉不洗，滴加相應一抗，4 ℃孵育過夜；次日二抗室溫孵育1 h，用新鮮配制的DAB顯色液顯色，蒸餾水沖洗3 次，梯度乙醇脫水至透明，通風櫥中風干，中性樹脂封片。

1.2.8 透射電鏡超微結構切片及染色 將小鼠尾部病變組織置于2.5%戊二醛固定液中固定，待充分固定后，制成超薄切片，然后在干凈的培養皿內放置蠟板，將醋酸鈾染液滴在蠟板上，將載有切片的載網覆于染液上（切片面接觸染液）染色15～30 min，蒸餾水沖洗切片，濾紙吸干，再將載網覆于檸檬酸鉛染液上染色5～10 min，蒸餾水沖洗切片，吸干，置于潔凈的培養皿內備用，電鏡觀察。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 4.0 軟件作圖并進行數據分析，數據用表示，數據分析采用獨立樣本t檢驗，統計分析圖為3次生物學重復實驗結果，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠感染Mm后尾組織病變情況Tet1+/+與Tet1-/-小鼠尾靜脈接種等量細菌后，觀察記錄小鼠尾組織大體病變（如膿腫形成等）情況。如圖1A、B 所示，Tet1+/+組小鼠在接種Mm后出現肉眼可見的皮膚破損，且隨著試驗周期的延長，組織病變呈進行性進展，潰爛面積逐漸增大，部分小鼠尾部創面化膿壞死，而Tet1-/-組小鼠尾部僅有輕微腫脹，膿腫程度明顯較Tet1+/+小鼠輕。菌載量計數發現Tet1+/+小鼠尾組織中細菌數量逐漸增多，而Tet1-/-小鼠菌載量呈遞減趨勢（圖1C），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 小鼠感染Mm 后尾組織大體病變、膿腫面積及菌載量比較Fig.1 Comparison of tail gross lesions，abscess area and bacteria loading after infection with Mm

2.2 小鼠尾組織HE 染色病理形態學觀察 小鼠接種細菌第20 天，取尾組織制作病理學切片，檢查炎癥細胞浸潤和肉芽腫的形成。鏡下觀察發現，Tet1+/+小鼠感染Mm后尾組織局部有明顯腫脹，炎癥細胞大量浸潤，伴局灶性壞死，有典型肉芽腫樣病灶形成（圖2C），而Tet1-/-小鼠僅出現少量炎癥細胞，小鼠尾組織病變明顯較輕（圖2D）。提示Tet1的缺失可明顯緩解小鼠尾組織損傷程度。

圖2 小鼠感染Mm后尾組織病理學觀察（×200）Fig.2 Histopathology examination of mice tails after Mm infection（×200）

2.3 小鼠尾組織抗酸染色觀察 抗酸染色發現Tet1+/+小鼠感染后分布有大量紅色桿菌，而Tet1-/-小鼠僅觀察到少許細菌分布（圖3）。此結果提示Tet1的缺失可增加機體抗菌及清除細菌的能力。

圖3 小鼠尾組織抗酸染色病理形態學觀察（×1 000）Fig.3 Pathomorphological observation of mice tail tissue by acid-fast staining（×1 000）

2.4 超微組織病理學觀察 比較Tet1+/+和Tet1-/-小鼠感染Mm后尾組織超微病理結構，二者有明顯的形態差異。觀察發現，Tet1+/+小鼠尾組織包含大量細菌，成團或分散存在，菌體細胞壁光滑無皺，電子密度較高（圖4A、C）；相反，Tet1-/-小鼠體內細菌菌體皺縮，折光性降低，細菌主要集中在吞噬體周圍（圖4B、D）。提示Tet1缺失后宿主更易募集大量細菌，促使吞噬細胞對細菌的吞噬、消化，幫助宿主抵抗Mm的入侵。

圖4 小鼠尾組織病變組織超微病理學觀察Fig.4 Ultrahistopathology observation of tail lesions in mice

2.5 MCs 的分布及形態變化 小鼠接種細菌第20 天，甲苯胺藍染色觀察小鼠尾組織中MCs的形態及數量差異（圖5A）。結果顯示，與Tet1+/+小鼠相比，Tet1-/-小鼠接種Mm后皮膚炎癥程度明顯較輕，MCs胞體較小且密度降低，脫顆粒細胞少見，其主要分布于組織表皮層區域，而Tet1+/+小鼠尾組織表皮層和真皮層均可見大量彌散分布的MCs。鏡下各計數100 個MCs，Tet1+/+小 鼠MCs 脫 顆 粒 數 明 顯 多 于Tet1-/-小鼠（圖5B）。提示Tet1可誘導MCs 活化，促進MCs脫顆粒。

圖5 小鼠感染Mm后尾部病變組織MCs觀察Fig.5 Observation of MCs in tail lesions of mice after infected with Mm

2.6 免疫組織化學染色觀察及統計 免疫組化染色技術檢測發現，Tet1+/+小鼠尾組織中類胰蛋白酶和5-HT陽性信號較強，且主要分布在炎癥區域；相反，在Tet1-/-小鼠尾組織中幾乎檢測不到這兩種介質的表達。進一步統計分析發現，Tet1+/+小鼠尾組織中類胰蛋白酶和5-HT 的表達明顯高于Tet1-/-小鼠，差異有統計學意義（圖6）。

圖6 小鼠感染Mm 后尾組織中類胰蛋白酶和5-HT 表達與分布Fig.6 Expressions and distribution of tryptase and 5-HT in mice tail tissues after infection with Mm

3 討論

MCs是參與結核病病理損傷的主要炎癥細胞之一，其通過直接接觸或釋放介質間接參與分枝桿菌急性和慢性感染狀態［20］。在分枝桿菌感染早期，主要是先天免疫反應發揮作用，當機體接觸到分枝桿菌時，細菌移位到黏膜屏障，與包括MCs 在內的各種免疫細胞相互作用，導致促炎介質的釋放［21］。結核桿菌不僅能通過細胞壁脂類成分如ESAT-6 和MPT-63 等活化MCs，也能分泌過氧化氫酶抑制MCs胞外誘捕網的形成以逃逸宿主免疫識別與殺傷［22-23］。研究報道，MTB可通過膽固醇依賴途徑入侵MCs，促使MCs 活化脫粒，并通過脂筏將細菌內化［23-24］。本實驗通過組織病理學觀察發現，感染了Mm的小鼠尾組織MCs 脫顆粒數增加，并伴隨大量炎癥細胞聚集，表明MCs 在Mm感染早期即可誘發炎癥反應，從而抑制細菌增長，對宿主發揮重要保護作用。細菌病原體可結合多種受體激活MCs，如大腸桿菌細胞壁脂多糖可通過TLR4 依賴途徑激活MCs，促使TNF-α 和IL-6 的產生［25］；金黃色葡萄球菌蛋白A 可與結合在FcεRI 上的IgE 不同區域相互作用以誘導MCs 釋放炎癥介質［26］。本研究中，Mm的入侵導致小鼠體內MCs 大量活化，類胰蛋白酶和5-HT 表達量明顯增加，這有助于宿主在早期感染中有效清除細菌。有研究證實，MCs 的過度激活與哮喘、自身免疫性關節炎等過敏性和炎癥性疾病的發生密切相關［27-28］。本研究中，Mm感染后導致MCs大量活化，MCs 脫粒釋放的炎癥介質既能誘導免疫應答，同時大量釋放的遞質又能導致炎癥病理損傷，提示在抗細菌感染的免疫應答中，MCs 的激活與脫顆粒釋放炎癥介質具有“雙刃劍”效應：其可幫助宿主抵抗細菌入侵，參與宿主炎癥反應及殺菌效應，但MCs的過度活化反而會加重宿主免疫損傷。

研究發現，Tet1不僅能調控樹突狀細胞激活參與過敏性鼻炎的發生，還能作為巨噬細胞活化后釋放TNF-α 的轉錄調控因子［29-30］。在過敏性氣道炎癥模型中發現，Tet1-/-小鼠表現為氣道高反應性和肺嗜酸性粒細胞增多，表現出比Tet1+/+小鼠更嚴重的疾病狀況［31］。在本研究中，Tet1+/+細菌載量明顯較Tet1-/-小鼠高，病變更嚴重，隨著感染時間的延長，宿主發揮抗菌免疫，幫助機體清除細菌，尾組織超微結果顯示，Tet1的存在可削弱宿主對細菌的吞噬能力，幫助細菌擴散增殖，但其具體機制仍需繼續探索。

Tet1可通過調節促炎細胞因子基因啟動子中的5-羥甲基化來促進巨噬細胞的激活，也可與THP-1和樹突狀細胞相互作用影響炎癥發展［30，32］。然而，在抗分枝桿菌感染過程中，Tet1是否參與MCs 活化的調控仍是未知的。本研究中，Tet1+/+小鼠尾組織中大量MCs 活化且表現出脫顆粒行為，而Tet1-/-小鼠僅有少量MCs 發生脫顆粒，且組織病理損傷明顯減輕，提示分枝桿菌感染過程中Tet1可能通過某種機制增強了MCs 的活化，進而協同MCs 活化并釋放炎癥介質，但該過程的詳細機制仍需繼續探索。有研究表明，Tet1的缺失會導致感染牙卟啉單胞菌后，宿主NF-κB 信號通路的活性下調，且IL-6、CCL2 的產生也隨之減少［33］。本實驗中，Tet1+/+小鼠尾部損傷呈漸進性發展，炎癥性病變嚴重，鏡下見大量MCs 被激活；而Tet1-/-小鼠尾組織炎癥細胞的募集明顯受到損害，小鼠組織炎癥損傷得到控制，即炎癥介質的陽性表達明顯降低。此外，Tet1可調控牙周疾病炎癥過程中巨噬細胞的活化，同時也在低氧誘導的炎癥調節中發揮關鍵作用［33-34］。課題組猜測，在Mm感染過程中，Tet1可能可以參與調控MCs 的活化及炎癥介質的釋放，參與機體的抗菌免疫。以上結果表明Tet1的缺乏會“適度”調節分枝桿菌感染過程中的炎癥病理損傷，平衡抗菌免疫反應和炎癥病理損傷在一定范圍內有序進行，尤其是Tet1具有重要的表觀遺傳調控功能，但其在抗分枝桿菌感染過程中的重要作用及其詳細機制尚需要進一步深入。

本研究通過建立Mm的小鼠尾靜脈感染模型，比較了Tet1+/+和Tet1-/-小鼠感染細菌后大體病變、菌載量、組織病理學等多方面的差異；同時，也探討了Tet1對MCs 活化與脫顆粒行為的影響。結果發現Tet1的缺失能有效緩解組織損傷，這種保護效應可能與Tet1能調控MCs 的活化和脫顆粒存在一定的內在關聯，但Tet1調控MCs 活化的具體機制及其在感染性疾病中所發揮的作用仍需進一步探索。