β-欖香烯對CLP誘導的膿毒癥大鼠肝損傷的保護作用①

康柳枝 張雅蘭 陳彩云 李劍冰 陳文發 （福建醫科大學附屬第二醫院藥學部，泉州 362000）

膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥綜合征，嚴重的膿毒癥可導致器官功能衰竭［1］。研究表明，全球膿毒癥病死率高達30%～70%，且呈逐年遞增趨勢［2-3］。目前已知膿毒癥是由炎癥反應、免疫功能紊亂、組織損傷等誘發，但其具體發病機制有待進一步闡明［4］。肝臟在機體代謝和免疫調節等過程中發揮重要作用，膿毒癥的發生可導致肝臟功能障礙并促進膿毒癥進展，同時，肝臟通過抑制炎癥反應、參與免疫調節等途徑在膿毒癥的發生進展中起調節作用［5-7］。因此，調節和改善肝功能是治療膿毒癥的有效手段。β-欖香烯是欖香烯的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎癥、免疫調節等藥理作用。有研究報道，β-欖香烯在肝損傷、肝炎及肝硬化等肝膽疾病中發揮保護作用［8］。PAN 等［9］指出，β-欖香烯通過降低促炎因子表達和調節免疫功能保護膿毒癥小鼠腦損傷，同時，β-欖香烯還可抑制NF-κB活化。本實驗通過建立盲腸結扎和穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）誘導的膿毒癥大鼠模型，探究β-欖香烯在膿毒癥大鼠肝損傷中的保護作用，并初步探索其作用機制，為β-欖香烯在膿毒癥治療及肝功能保護中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 β-欖香烯（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司（CAS 號：515-13-9）；ELISA 試劑盒購自美國Sigma 公司（貨號：MAK055-1KT、MAK052-1KT、MAK045-1KT、RAB0247-1KT）；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）含量測定試劑盒（ab203359）、兔單克隆抗體caspase3（ab214430）、兔單克隆抗體caspase9（ab202068）、兔單克隆抗體NF-κB P65（ab239882）以及對應的HRP 標記的二抗均購自美國Abcam 公司。病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）；光學顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；臺式高速離心機（DragonLab，D3024R）；酶標儀（Rayto，RT-6100）；成像系統（日本尼康，Nikon DS-U3）；全自動生化分析儀（邁瑞BS2000M）。

1.1.2 實驗動物 50 只清潔級Wistar 雄性大鼠（8～10 周齡，體質量200～250 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，使用許可證號：SYXK（京）2017-0033，實驗動物嚴格遵守3R原則，并通過福建醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、建模及給藥 每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴格、規范的卡片登記管理，24 ℃條件下封閉群養。將50 只Wistar 大鼠以隨機數字表法分為健康對照組、模型組、模型+β-欖香烯25 mg/kg 組、模型+β-欖香烯50 mg/kg 組、模型+β-欖香烯100 mg/kg 組，10 只/組。模型組和模型加藥組大鼠參照文獻［10-11］采用CLP 誘導建立膿毒癥大鼠模型，10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉，腹部消毒后正中開腹，絲線結扎盲腸根部，以無菌絲線結扎盲腸遠端1～1.5 cm處，18號無菌針頭在已經結扎的盲腸遠端中央處貫通穿刺，擠出少量內容物后將盲腸原位推回至腹腔并縫合切口，健康對照組只開腹、關腹并復蘇，不進行CLP。術后1 h 模型加藥組參照文獻［12］分別灌胃給藥25、50、100 mg/kg β-欖香烯，健康對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，于術后12 h 和24 h 收集各組大鼠外周血。術后48 h斷頭法處死各組大鼠并收集肝臟組織，部分置于-80 ℃冰箱中凍存用于分子試驗，剩余部分以4%多聚甲醛固定用于免疫組化和HE染色。

1.2.2 肝臟生化指標和功能檢測 術后12 h和24 h分別取血，于4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，取上清，通過全自動血清生化分析儀檢測血清中天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酸氨基轉移酶（glutamate aminotransferase，ALT）、高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、三酰甘油（triglyceride，TG）水平。同時收集外周血，按ELISA 試劑盒操作說明書測定血清和肝組織中iNOS和IL-10含量。

1.2.3 HE 染色觀察肝臟組織病理損傷程度 取4%多聚甲醛固定的肝臟組織，石蠟包埋切片，經脫蠟水化后進行HE 染色，光鏡下觀察并拍照，記錄組織形態學變化，細胞核呈藍紫色，細胞質呈紅色。隨機選取10 個視野采用Knodell 評分法對各組大鼠進行肝臟組織病理損傷評分，評分標準：大鼠肝臟組織匯管區有無碎屑樣壞死、肝小葉細胞是否變性和局灶壞死以及匯管區和肝小葉炎癥程度，具體評分標準參照文獻［11］。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達 取凍存的肝臟組織，于室溫條件下解凍并研磨均勻，采用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取肝臟組織總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度和純度，每孔上樣30 μg，經SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉后，加入一抗（1∶500），4 ℃搖床孵育過夜，回收一抗殘留液，加入HRP 標記的對應二抗（1∶4 000），室溫孵育2 h，采用ECL 化學發光法于暗室中曝光顯影（GAPDH 作內參）。膠片掃描存檔，Photoshop 整理去色，Alpha 軟件分析光密度值，計算各組大鼠caspase-3、caspase-9 及p-P65/P65 蛋白相對表達量，結果以目的條帶和內參GAPDH 比值表示，重復實驗3次，最終結果取平均值。

1.2.5 免疫組化檢測p-P65 表達水平 取4%多聚甲醛固定的肝臟組織，石蠟包埋切片，組織切片行抗原修復，加入內源性過氧化物酶，經血清封片后，加入一抗孵育過夜，再以二抗室溫孵育60 min，加DAB 顯色液，水洗終止顯色，蘇木素復染細胞核，脫水后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察拍照，蘇木素染細胞核呈藍色，DAB 染陽性細胞呈棕黃色。采用IPP 軟件分析肝臟組織染色的光密度值，取平均值表示肝臟組織中NF-κB P65的表達情況。

1.3 統計學分析 使用SPSS17.0 和GraphPad prism6.0 軟件統計數據，正態分布的計量資料表示為。多組數據比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β-欖香烯對膿毒癥大鼠血清中AST 和ALT 水平的影響 各組大鼠血清中AST 水平分別為（146±25）、（365±43）、（359±36）、（268±29）、（186±35）U/L，ALT 水 平 分 別 為（37±16）、（164±27）、（158±31）、（116±24）、（72±25）U/L。與健康對照組相比，模型組大鼠血清中AST 和ALT 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，25 mg/kg β-欖香烯給藥治療后膿毒癥大鼠血清中AST 和ALT 水平差異無統計學意義（F=3.211、3.098；P=0.095、0.102），經50、100 mg/kg β-欖香烯給藥治療后，膿毒癥模型大鼠血清中AST和ALT水平顯著降低（P＜0.05），見圖1。結果提示：β-欖香烯可降低膿毒癥大鼠血清中AST 和ALT 水平，改善膿毒癥大鼠肝功能。

圖1 各組大鼠血清中AST和ALT水平的變化Fig.1 Changes of AST and ALT levels in serum of rats in each group

2.2 β-欖香烯對膿毒癥大鼠血清中LDL、HDL、TG水平的影響 各組大鼠血清中LDL 水平分別為（0.18±0.040）、（0.66±0.077）、（0.63±0.056）、（0.46±0.070）、（0.30±0.060）mmol/ml，HDL 水 平 分 別 為（1.42±0.01）、（0.46±0.14）、（0.50±0.10）、（0.79±0.22）、（1.19±0.17）mmol/L，TG 水平分別為（0.24±0.06）、（0.97±0.08）、（0.93±0.11）、（0.63±0.08）、（0.38±0.09）mmol/L。與健康對照組相比，模型組大鼠血清中LDL 和TG 水平明顯升高，HDL 水平降低（P＜0.05）。與模型組相比，經25 mg/kg β-欖香烯治療后，膿毒癥大鼠血清中LDL、HDL、TG 水平差異無統計學意義（F=1.750、1.664、2.573；P=0.292、0.301、0.188），經50、100 mg/kg β-欖香烯治療后，膿毒癥大鼠血清中LDL 和TG 水平顯著降低，HDL水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。提示β-欖香烯對膿毒癥大鼠肝臟功能具有保護作用。

圖2 各組大鼠血清中LDL、HDL、TG水平變化Fig.2 Changes of LDL，HDL and TG levels in serum of rats in each group

2.3 β-欖香烯對膿毒癥大鼠肝臟病理損傷的影響 HE 染色結果表明，健康對照組大鼠肝臟組織結構正常，肝細胞大小均勻，匯管區和肝小葉結構正常，未見病理變化。模型組大鼠肝臟組織結構紊亂，肝細胞損傷嚴重，肝小葉結構不清，胞核消失，肝小葉和匯管區可見炎癥浸潤。與模型組相比，模型+β-欖香烯25 mg/kg 組肝臟組織病理損傷無明顯變化。模型+β-欖香烯50 mg/kg 組大鼠肝臟組織結構較模型組有所改善，可見結構正常的肝細胞和肝小葉。模型+β-欖香烯100 mg/kg組大鼠肝臟組織結構正常，肝細胞大小均勻，未見炎癥浸潤，且肝臟病理損傷Knodell 評分依次為模型組＞模型+β-欖香烯25 mg/kg組＞模型+β-欖香烯50 mg/kg組＞模型+β-欖香烯100 mg/kg 組＞健康對照組，見圖3。結果提示β-欖香烯可改善膿毒癥大鼠肝臟組織病理損傷。

圖3 各組大鼠肝臟組織HE染色（×400）Fig.3 HE staining of liver tissue of rats in each group（×400）

2.4 β-欖香烯對膿毒癥大鼠肝臟組織中凋亡蛋白表達水平的影響 Western blot 結果表明，各組大鼠肝臟組織中cleaved cas9/cas9 蛋白表達水平分別為0.02±0.015、0.90±0.07、0.88±0.08、0.38±0.05、0.04±0.025，cleaved cas3/cas3 蛋白表達水平分別為0、0.94±0.09、0.30±0.06、0.06±0.03、0.02±0.015。與健康對照組相比，模型組大鼠肝臟組織中cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，經25 mg/kg β-欖香烯給藥處理后，cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3 蛋白表達水平差異無統計學意義（F=1.077、1.842；P=0.395、0.218），經50、100 mg/kg β-欖香烯給藥處理后，cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3 蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。提示β-欖香烯通過抑制膿毒癥大鼠肝臟組織中凋亡蛋白表達減少肝細胞凋亡。

圖4 各組大鼠肝臟組織中cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3蛋白表達水平Fig.4 Protein expression levels of cleaved cas9/cas9 and cleaved cas3/cas3 in liver tissues of rats in each group

2.5 β-欖香烯對膿毒癥大鼠血清及肝組織中iNOS和IL-10含量的影響 各組大鼠血清中iNOS含量分別為（20±5）、（187±35）、（179±30）、（132±28）、（58±10）pg/ml，IL-10 含 量 分 別 為（5±2.0）、（9±2.6）、（9.3±2.4）、（15±3.6）、（21±4）pg/ml；肝組織中iNOS含量分別為（13±5）、（99±13）、（92±16）、（68±15）、（31±9）pg/ml，IL-10 含 量 分 別 為（4±1.0）、（8.3±1.6）、（8.6±1.3）、（13.8±2.0）、（21.3±1.8）pg/ml。與健康對照組相比，模型組大鼠血清及肝組織中iNOS和IL-10 均高表達（P＜0.05）；與模型組相比，經25 mg/kg β-欖香烯給藥治療后，膿毒癥大鼠血清及肝組織中iNOS 和IL-10 含量差異無統計學意義（F=2.672、1.980；P=0.091、0.124），經50、100 mg/kg β-欖香烯給藥治療后，膿毒癥大鼠血清和肝組織中iNOS 含量明顯降低，IL-10 含量增高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。提示β-欖香烯通過調控iNOS 和IL-10 含量水平在膿毒癥大鼠血清和肝組織免疫系統中發揮調節作用。

圖5 各組大鼠血清和肝組織中iNOS、IL-10蛋白表達水平Fig.5 Expression levels of iNOS，IL-10 protein in serum and liver tissue of rats in each group

2.6 β-欖香烯對膿毒癥大鼠肝組織中p-P65/P65蛋白表達水平的影響 免疫組化和Western blot 檢測各組大鼠肝組織中p-P65/P65 蛋白表達水平，圖6B結果顯示，各組大鼠肝組織中p-P65/P65 蛋白表達水平分別為4±3、32±7、30±8、16±6、11±5，圖6C、D結果顯示，p-P65/P65 蛋白表達水平分別為0.01±0.006、0.18±0.020、0.16±0.040、0.04±0.020、0.02±0.014。與健康對照組相比，模型組大鼠肝組織中p-P65/P65 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，經25 mg/kg β-欖香烯治療后，膿毒癥大鼠肝組織p-P65/P65 蛋白表達水平差異無統計學意義（F=1.334、P=0.305），50、100 mg/kg β-欖香烯顯著降低膿毒癥大鼠肝組織中p-P65/P65 蛋白表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。提示β-欖香烯通過下調NF-κB P65蛋白表達在膿毒癥大鼠肝組織中發揮調節作用。

圖6 各組大鼠肝組織中p-P65/P65蛋白表達水平Fig.6 Expression level of p-P65/P65 protein in liver tissues of rats in each group

3 討論

膿毒癥與肝功能密切相關，兩者相互制約，相互影響。膿毒癥發生時，大量炎癥介質、黏附分子釋放導致肝臟功能衰竭，而肝臟又通過清除毒素、介導炎癥反應和免疫反應發揮機體保護作用［13］。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型檢測肝臟生化指標和肝臟病理損傷程度，結果顯示，模型大鼠肝臟生化指標AST、ALT水平明顯升高，血清中HDL水平降低，LDL 和TG 升高，肝臟組織病理損傷嚴重。蘭天罡等［14］發現，β-欖香烯對肝癌患者肝功能具有明顯改善效果。本研究結果顯示，經β-欖香烯治療后，膿毒癥大鼠肝臟生化指標和肝功能異常指標明顯降低，組織病理損傷得到改善，提示β-欖香烯對膿毒癥大鼠肝功能具有保護作用，因此，β-欖香烯可能作為膿毒癥肝損傷的潛在治療藥物。

為明確β-欖香烯保護膿毒癥大鼠肝功能的作用機制，研究組分別檢測了膿毒癥大鼠血清和肝組織中凋亡蛋白、免疫調節因子及炎癥水平。凋亡蛋白caspase9 和caspase3 是細胞凋亡重要的起始蛋白和執行蛋白，受外界信號刺激后，凋亡起始蛋白caspase9被異常激活，產生大量cleaved cas9并引起caspase 級聯反應，活化的caspase9 起始下游的凋亡執行蛋白caspase3，caspase3被激活后進一步啟動細胞凋亡途徑［15］。高建芝等［16］發現，膿毒癥大鼠肝組織中凋亡蛋白caspase3高表達，肝細胞凋亡異常增多。也有文獻報道，膿毒癥大鼠肝臟組織中凋亡蛋白高表達加劇膿毒癥進展［17］。本實驗結果顯示，膿毒癥大鼠肝臟組織中cleaved cas9 和cleaved cas3 均高表達，經β-欖香烯給藥治療后，膿毒癥大鼠肝臟組織中cleaved cas9 和cleaved cas3 蛋白表達水平顯著降低。提示β-欖香烯通過降低膿毒癥大鼠肝臟組織中凋亡蛋白表達抑制細胞凋亡，緩解膿毒癥大鼠肝損傷。

IL-10是炎癥反應和免疫反應的抑制因子，能夠抑制炎癥細胞釋放炎癥因子，同時，IL-10 在抑制細胞因子產生、抗原呈遞及T 細胞增殖過程中也發揮重要調控作用。LIANG 等［18］通過建立CLP 誘導的膿毒癥大鼠模型，檢測大鼠血清和肝臟組織中IL-10含量，結果表明，IL-10 在膿毒癥大鼠血清和肝臟組織中低表達，經脂肪間充質干細胞分泌的sTNFR1治療后，IL-10 含量明顯升高。iNOS 是促進炎癥和免疫反應的介導因子，激活iNOS可生成大量的NO，誘導機體氧化應激，促進炎癥因子表達［19］。研究發現，iNOS 在膿毒癥大鼠肝臟中高表達，抑制TLR4/NF-κB 通路可降低肝臟中iNOS 表達水平［20］。本研究結果顯示，膿毒癥大鼠血清和肝臟中IL-10 和iNOS 均高表達，經β-欖香烯治療后，膿毒癥大鼠血清和肝臟中IL-10 含量增多，iNOS 含量降低。提示β-欖香烯通過調節膿毒癥大鼠血清和肝臟中IL-10和iNOS含量調控大鼠免疫反應和炎癥反應。

研究表明，膿毒癥大鼠肝損傷及炎癥反應與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路密切相關［21-22］。為進一步明確β-欖香烯調節膿毒癥大鼠肝臟中凋亡蛋白、炎癥因子和免疫調節因子表達水平的作用機制，本實驗檢測了膿毒癥大鼠肝臟細胞中NF-κB P65 蛋白表達水平，NF-κB 是細胞內重要的核轉錄因子，NF-κB蛋白家族常參與細胞炎癥反應、凋亡、免疫應答等過程［23］。NF-κB 激活通常是指P65 磷酸化后，NF-κB 從胞質轉移至胞核中從而啟動下游靶基因轉錄，如TNF-α、IL-6、iNOS 等［24］。本實驗結果顯示，膿毒癥大鼠肝臟細胞中p-P65/P65蛋白表達水平異常增高，經β-欖香烯給藥治療后，膿毒癥大鼠肝臟細胞中p-P65/P65 蛋白表達水平顯著降低，結果表明，β-欖香烯可抑制NF-κB P65通路蛋白表達，結合前期研究結果提示，β-欖香烯通過抑制NF-κB P65 蛋白表達緩解膿毒癥大鼠因細胞凋亡、炎癥反應和免疫失調引起的肝損傷。

綜上所述，β-欖香烯在膿毒癥大鼠肝損傷中具有調節作用，其作用機制可能是通過抑制NF-κB P65 通路下調凋亡蛋白、炎癥因子和免疫調節因子水平。