化濁解毒活血通絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠LPS 及TLR4/NF-κB 信號通路的影響①

霍瑞卿 田軍彪 趙敏菡 李芳釗 孫 闊 韓宇帆 （河北中醫學院，石家莊 050200）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（250±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK-（京）2016-0006。所有動物飼養于河北中醫學院SPF 級動物房，21～25 ℃，自由飲食取水。適應性喂養7 d 后用于后續實驗。動物實驗經河北中醫學院動物倫理委員會批準。

1.1.2 藥物及試劑 化濁解毒活血通絡方（黃連6 g、茯苓15 g、澤瀉6 g、丹參15 g、赤芍15 g、當歸9 g、石菖蒲15 g、郁金15 g、川芎9 g、地龍15 g、甘草6 g，為廣東一方制藥有限公司生產的中藥顆粒）；鱟試劑（ECK-0882，湛江安度斯生物有限公司）；IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（SXR087、SXR039，上海森雄科技實業有限公司）；NF-κB（8242S，CST）；TLR4、Occludin 抗 體（ab13867、ab216327，美 國Abcam）；ZO-1（40-2300，美國Thermo Fisher Scientific）；β-actin（bs-0061R，北京博奧森生物技術有限公司）；Eastep Super Total RNA Extraction Kit、GoTaq qPCR Master Mix（LS1040、A6002，Promega）；Primers（260064816，生工上海總部合成部）。

1.1.3 儀器 7170A 型全自動生化儀、BX53 型顯微鏡、721 型可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；RM2015 型切片機、CM1950 型冰凍切片機（德國Leica 公司）；KZ-Ⅱ型勻漿儀（北京Servicebio 公司）；2720 基因擴增儀（美國AB 公司）；CFX96 實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad）；D3024R 型離心機（北京DragonLab公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構建及分組 60只SPF級SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為假手術組（Sham）、模型組（MCAO）、化濁解毒活血通絡方低（TCM-L）、中（TCM-M）、高（TCM-H）組劑量組，每組12 只。改良線栓法建立缺血再灌注損傷模型：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，頸部皮膚乙醇消毒，頸正中線開口，鈍性分離右側頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內動脈（internal carotid artery，ICA），穿線備用。夾閉CCA近心端和ICA，ECA近頭端兩條線系死結，ECA 近心端線系活結，ECA 近心端兩條線間剪一倒“V”小口，插入線栓，系緊ECA 近心端線，固定線栓，將ECA 提起，解開ICA 動脈夾，緩慢推送線栓至ICA，線端進入1.8 cm 左右感有一定阻力時停止推進，解開CCA 動脈夾，此時線栓頭端正好位于大腦中動脈（middle artery，MCA）起始部，即導致阻斷，缺血2 h 后拔出線栓［16］。術后快速對MCAO 模型大鼠進行神經行為學評分，0 分：無神經功能缺損癥狀；1 分：輕度局灶性神經功能缺損，病灶對側（左側）前爪不能完全伸展；2 分：中度局灶性神經功能缺損，行走時向病灶對側（左側）轉圈；3 分：重度局灶性神經功能缺損，行走時向病灶對側（左側）傾倒；4 分：不能自發行走并出現意識障礙。評分＞1 分即可從神經缺損評分角度認為造模成功，每組選取3 只大鼠進行TTC 染色，梗死區腦組織呈白色則為造模成功。

高職院校一線教師大多由高學歷背景、高研究能力的碩博研究生組成，他們擁有較強的教學能力和科研能力，能夠承擔較重的教學任務，然而缺乏敏銳的市場洞察力，科研課題偏重基礎理論的研究，應用型研究較少。在選擇科研項目時，重點考慮學術水平的高低和項目的新穎性，忽視了研究成果產品化的可行性，導致研究成果與實際市場需求脫節。

1.2.2 干預方法 化濁解毒活血通絡方低、中、高各劑量組分別灌胃給予6.25、12.5、25 g/kg 化濁解毒活血通絡方2 ml，假手術與模型組灌胃給予2 ml生理鹽水，1次/d，連續3 d。再灌注72 h后戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，腹主動脈采取血液，取腦、結腸組織，一部分-80 ℃保存，一部分固定于4%多聚甲醛溶液。

1.2.3 神經功能缺損評分 腦缺血再灌注72 h 后采用改良版神經功能評分進行大鼠神經行為學評分［17］。

1.2.4 腦梗死面積測定 灌胃給藥3 d 后麻醉大鼠，斷頭取腦，生理鹽水沖洗，-20 ℃速凍20 min，置于腦槽中切片，TTC 染色，Image J 軟件測定腦梗死范圍百分比（%）。

1.2.5 病理學形態檢測 取大鼠腦、結腸組織置于4%多聚甲醛液中固定，石蠟包埋，常規切片，梯度乙醇脫水，HE 染色，顯微鏡下觀察大鼠腦、結腸組織細胞形態變化。

1.2.6 TUNEL 檢測腦組織細胞凋亡 取腦組織常規石蠟切片，二甲苯浸洗2次脫蠟，5 min/次，梯度乙醇浸洗水化，滴加蛋白酶K 消化增加細胞通透性，37 ℃孵育20 min，滴加100 μl TUNEL 反應混合液加蓋玻片，37 ℃避光孵育1 h，滴加50 μl converterPOD加蓋玻片，37 ℃避光孵育30 min，100 μl DAB 混合液顯色，室溫反應10 min，蘇木素復染3 min后沖洗，鹽酸-乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下統計凋亡細胞數（凋亡細胞被染色），隨機挑選5個視野計數并拍照。

1.2.7 LPS 含量檢測 取100 μl 血清，參照鱟試劑盒說明書檢測LPS含量。

1.2.8 ELISA 檢 測 腦 組 織IL-1β、TNF-α 及 血 清DAO 含量 參照ELISA 試劑盒說明書，檢測大鼠腦組織勻漿上清中IL-1β、TNF-α 含量，同時測定其總蛋白濃度用以校正，血清中DAO 含量測定嚴格按照說明書進行。

1.2.9 Western blot 檢測腦組織TLR4、NF-κB 及腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達 剪取腦組織、結腸組織各100 mg，加入RIPA 細胞裂解液1 ml 裂解，離心10 min，取上清，與上樣緩沖液加熱后進行10%SDSPAGE 凝膠電泳，轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗（1∶800 稀釋）4 ℃孵育過夜，反復洗膜，加入二抗（1∶5 000 稀釋）室溫孵育2 h；ECL 發光，凝膠成像儀內觀察蛋白條帶并拍照，以β-actin為內參，Image J 軟件定量分析蛋白相對表達，實驗重復3 次。分別計算TLR4、NF-κB、ZO-1、Occludin蛋白相對表達。

1.2.10 RT-PCR 檢 測 腦 組 織MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表達 取腦組織100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 ml TRIzol 勻漿，提取總RNA，采用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒逆轉錄為cDNA，以此cDNA 作為熒光定量模板，按照特定反應體系和反應條件進行擴增，Real time PCR反應采用兩步法反應程序，預變性95 ℃10 min，44 個循環：95 ℃15 s，60 ℃60 s，4 ℃保存。引物采用Premier 5 軟件設計（表1），以β-actin 為內參，Relative Quantification Study 法分析，2-ΔΔCt法計算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統計學分析 采用Prism7.0 軟件進行統計學分析，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠神經功能缺失評分的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠神經功能缺失評分顯著升高（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M 組大鼠神經功能缺失評分降低（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L 組大鼠神經功能缺損評分升高（P＜0.05，表2）。

表2 各組大鼠神經功能缺失評分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of neurological deficit score of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠神經功能缺失評分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of neurological deficit score of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L 0 10.10±1.521）7.70±1.062）8.10±0.992）9.90±1.103）Neurological deficit score

2.2 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠腦梗死面積的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠腦梗死面積顯著增加（P＜0.05）；與MCAO組相比，TCM-H、TCM-M組大鼠腦梗死面積顯著縮小（P＜0.05，表3、圖1）。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色Fig.1 TTC staining of brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦梗死面積比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of cerebral infarct area of rats in each group（±s，n=3）

表3 各組大鼠腦梗死面積比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of cerebral infarct area of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L Infarct volume/%0 28.32±2.321）13.92±0.792）15.29±5.632）22.40±2.50

2.3 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠腦組織病理形態學變化的影響 Sham 組大鼠腦組織未見異常改變，細胞排列整齊，染色均勻，細胞膜完整，細胞核清晰可見，無變形壞死細胞；MCAO 組大鼠腦組織缺血區域可見大量細胞變性、壞死，細胞排列紊亂，細胞間隙增大，胞漿染色變淺，細胞核固縮、深染，有炎癥細胞浸潤；與MCAO 組相比，化濁解毒活血通絡方各組腦組織病理狀態有所改善，TCM-H 組改善最為顯著（圖2）。

圖2 各組大鼠腦組織病理學改變（HE染色）Fig.2 Pathological changes in brain tissue of rats in each group（HE staining）

2.4 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠腦組織細胞凋亡的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠腦細胞凋亡率明顯上升（P＜0.05）；與MCAO組相比，TCM-H和TCM-M 組大鼠腦細胞凋亡率下降（P＜0.05）；與TCM-L 組相比，TCM-H 組大鼠腦細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，表4、圖3）。

圖3 TUNEL染色法標記凋亡陽性細胞Fig.3 Apoptotic positive cells labeled by TUNEL staining

表4 各組大鼠腦細胞凋亡率（±s，n=3）Tab.4 Apoptosis rate of cells in brain of rats in each group（±s，n=3）

表4 各組大鼠腦細胞凋亡率（±s，n=3）Tab.4 Apoptosis rate of cells in brain of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L Apoptosis rate/%9.80±0.87 44.05±2.321）24.12±1.802）28.26±1.642）37.72±0.813）

2.5 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠血清LPS、DAO表達的影響 與Sham組相比，MCAO組大鼠血清LPS、DAO 含量上升（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H 組大鼠血清LPS、DAO 含量下降（P＜0.05）；與TCM-L 組相比，TCM-H 組大鼠血清LPS、DAO 含量下降（P＜0.05，表5）。

表5 各組大鼠血清LPS、DAO含量（±s，n=3）Tab.5 Serum LPS and DAO contents of rats in each group（±s，n=3）

表5 各組大鼠血清LPS、DAO含量（±s，n=3）Tab.5 Serum LPS and DAO contents of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L LPS/（EU·ml-1）0.06±0.21 0.10±0.131）0.08±0.152）0.08±0.14 0.10±0.103）DAO/（U·L-1）3.96±0.82 6.01±0.971）4.61±0.872）4.66±0.352）5.62±0.433）

2.6 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠結腸病理形態學變化的影響 Sham 組大鼠結腸黏膜未見明顯損傷。與Sham 組相比，MCAO 組大鼠結腸黏膜少許破壞，黏膜水腫，絨毛形態不規則，局部出現黏膜破損，化濁解毒活血通絡方治療后上述情況好轉（圖4）。

圖4 各組大鼠結腸組織HE染色Fig.4 HE staining for colon tissues of rats in each group

2.7 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠結腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達的影響 與Sham 組相比，MCAO 組 大 鼠Occludin、ZO-1 蛋 白 表 達 降 低（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M 組大鼠Occludin、ZO-1蛋白表達有所增加，TCM-H組趨于正常（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L 組ZO-1 蛋白表達降低（P＜0.05，圖5）。

圖5 各組大鼠結腸Occludin、ZO-1蛋白表達水平比較Fig.5 Comparison of colon Occludin and ZO-1 protein expression levels of rats in each group

2.8 化濁解毒活血通絡方對CIRI大鼠腦組織IL-1β、TNF-α 表達的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠IL-1β、TNF-α 表達增加（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M組IL-1β、TNF-α表達減少（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L 組大鼠IL-1β、TNF-α 表 達增加（P＜0.05，表6）。

表6 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α表達（±s，n=3，pg/mg）Tab.6 IL-1β and TNF-α expressions of brain tissues of rats in each group（±s，n=3，pg/mg）

表6 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α表達（±s，n=3，pg/mg）Tab.6 IL-1β and TNF-α expressions of brain tissues of rats in each group（±s，n=3，pg/mg）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L IL-1β 35.65±3.97 84.22±3.901）38.46±1.592）47.91±1.372）75.33±3.373）TNF-α 12.62±1.10 39.96±1.011）19.56±1.842）27.21±0.862）36.50±1.663）

2.9 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠腦組織TLR4、NF-κB 蛋白表達的影響 與Sham 組相比，MCAO 組 大 鼠TLR4、NF-κB 蛋 白 表 達 增 加（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M 組大鼠TLR4、NF-κB 蛋白表達減少（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達增加（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組大鼠缺血側腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達Fig.6 TLR4 and NF-κB protein expressions in ischemic lateral brain tissue of rats in each group

2.10 化濁解毒活血通絡方對CIRI 大鼠腦組織MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表達的影響 與Sham組相比，MCAO 組大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表達增加（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H 組大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表達減少（P＜0.05）；與TCM-H 組 相比，TCM-L 組大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表達增加（P＜0.05，圖7）。

圖7 各組大鼠缺血側腦組織中MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表達比較Fig.7 Comparison of MyD88，IRAK，TRAF6 mRNA expressions of cerebral tissues on ischemic side of rats in each group

3 討論

缺血性卒中是指局部腦組織區域血液供應障礙導致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而導致神經功能缺失的表現，高發于50～60歲人群，男性稍多于女性，具有高發病率、高致殘率、高病死率等特點，常合并動脈硬化、高血壓、高脂血癥或糖尿病等危險因素或全身性非特異性癥狀［18］。神經系統的癥狀與閉塞血管供血區域腦組織及鄰近受累腦組織功能有關［19］。靜脈溶栓和介入取栓技術迅猛發展，為缺血性卒中提供了新的有效治療手段［20-21］。但靜脈溶栓和介入取栓均面臨CIRI 問題。CIRI 指在短時間內血液灌注恢復后，神經細胞凋亡進一步加劇病理過程，導致腦組織進一步損傷。因此，治療CIRI 是缺血性卒中治療成功與否的關鍵。目前，西醫在CIRI治療方面尚無有效手段，如何治療CIRI成為缺血性卒中治療的瓶頸。CIRI 包括細胞自噬、細胞凋亡、線粒體功能障礙、氧化應激和炎癥損傷等發病機制，其中炎癥損傷是CIRI發生發展的重要環節，如何有效控制炎癥損傷對改善CIRI 至關重要［22-23］。因此，本文從炎癥相關通路探討化濁解毒活血通絡方對CIRI的保護作用。

缺血性卒中屬于中醫中風范疇，痰濁、濕熱、瘀毒是其主要致病因素，“濁凝閉阻清竅，瘀毒損傷腦絡”是其核心病機。腦卒中后，產生大量自由基、促炎因子不斷聚集導致大腦持續缺血缺氧，導致血腦屏障破壞，微循環障礙。同時，卒中后會導致胃腸功能應激狀態，腸道菌群紊亂，腸道菌群代謝產物內毒素增多，引起腸道屏障破壞，內毒素經血液循環進一步促進內環境失衡，因機體無法清除這些致病因素形成“瘀毒”使腦損傷進一步加重。化濁解毒活血通絡方是田軍彪教授基于以上理論及總結多年臨床經驗探索出的治療缺血性卒中的中藥復方，臨床療效確切。化濁解毒活血通絡方中黃連清熱燥濕、瀉火解毒，茯苓、澤瀉健脾利水滲濕，赤芍、丹參、當歸、川芎活血行氣化瘀，川芎味辛上行頭目，有引藥上行之效，石菖蒲、郁金降氣化痰祛濕，地龍清熱息風，甘草調和諸藥。諸藥合用健脾祛濕化痰、清熱活血通絡，既能調節腸腑功能又能減輕腦絡損傷。現代藥理研究表明，茯苓三萜、丹參酮和小檗堿具有調節免疫功能、減輕炎癥損傷、保護腸道黏膜、維持腸道菌群穩態作用［24-26］。研究發現芍藥苷和地龍水提取液可抑制促炎因子TNF-α、IL-1β表達從而減輕CIRI［27-28］。

細菌LPS 是一種細菌內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁中發現的炎癥標志物。研究表明，細菌LPS與缺血性卒中有關。LIN 等［29］研究表明，缺血性腦卒中患者存在4 種細菌代謝途徑，其中LPS 合成在缺血性腦卒中患者中明顯富集，與健康對照組相比，卒中病例中觀察到LPS合成富集，枸杞多糖可提高腦卒中敗血癥發生率。卒中后腸道菌群紊亂，菌群代謝產物LPS 增多，選擇性增加大鼠結腸和回腸血管通透性，導致腸道屏障破壞后隨血液循環進入大腦。LPS 可能通過兩種途徑進入大腦，一是通過血腦屏障薄弱區域進而在腦內彌散；二是通過與血清蛋白結合被血腦屏障中有特殊轉運功能的內皮細胞所攝取［30］。

腸道屏障在防止腸腔內有害物質如細菌和內毒素進入血液循環到達其他組織、器官中具有重要作用。腸道屏障以機械屏障最為重要，其結構為完整的腸黏膜上皮細胞及上皮細胞間緊密連接。ZO-1和Occludin 是腸道黏膜屏障完整性的標志蛋白，DAO 能夠反映腸道機械屏障完整性和受損程度。缺血性卒中發生后，由于腸道應激狀態及腸道菌群紊亂導致腸道黏膜屏障破壞，通透性增加。張楓［31］通過透射電鏡觀察發現腦缺血再灌注7 d 后，腸道上皮屏障緊密連接超微結構改變，緊密連接條帶變暗，結構疏松，微絨毛紊亂。張芯［32］研究發現，CIRI小鼠結腸黏膜通透性增加，血清DAO濃度升高。

課題組前期研究發現，CIRI 大鼠血腦屏障通透性增加，經化濁解毒活血通絡方治療后缺血側梗死腦組織密連接蛋白ZO-1、Occludin表達增加，血腦屏障通透性降低［33］。本研究發現，與Sham 組相比，MCAO 組大鼠血清LPS 增加，腸黏膜水腫，炎癥細胞浸潤，黏膜破損，結腸組織ZO-1、Occludin表達降低，腸道屏障破壞，經化濁解毒活血通絡方治療后LPS水平降低，腸道黏膜屏障得以恢復，與上述研究結論一致，因此，推測化濁解毒活血通絡方減輕CIRI與減少LPS表達、修復黏膜屏障有關。

TLR4/NF-κB 信號通路與缺血性卒中密切關系［34］。研究發現，LPS 能夠與天然免疫識別受體TLR4 結合，進而介導跨膜信號轉錄［35］。TLR4 被LPS 激活后與MyD88 的TIR 結構域結合激活MyD88，形成有活性的TLR4/MyD88 復合物，通過其氨基端結構域招募IL-1 受體相關激酶（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK）家族成員，使其磷酸化后與腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）結合，促使NF-κB 和NF-κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factorκB，IκB）解聚，核定位序列暴露，從而被轉運至細胞核內促進NF-κB 依賴的基因轉錄，進一步促進大量炎癥因子轉錄并釋放，包括TNF-α、IL-1β，導致腦組織損傷［36-37］。與此同時，TNF-α 也可刺激單核-巨噬細胞生成一系列炎癥因子，如IL-1、IL-6、IL-8 等，引起瀑布反應，進一步加重缺血區域腦組織損傷，與本研究結論一致［38］。本研究發現，與Sham 組相比，TLR4、MyD88、IRAK、TRAF6、NF-κB及炎癥因子IL-1β、TNF-α表達明顯上調，與MCAO 組相比，化濁解毒活血通絡方治療后上述指標均不同程度下調，表明化濁解毒活血通絡方可調控LPS-TLR4/NF-κB 信號通路改善CIRI。

綜上所述，本研究證實化濁解毒活血通絡方可保護腸道黏膜屏障，明顯降低CIRI 大鼠血清LPS 水平，抑制TLR4/NF-κB 通路過度激活，降低促炎因子IL-1β、TNF-α表達，對CIRI起保護作用，為臨床用藥提供了理論支持。