基于分子互作網絡探討丹蔞片干預PI3K/AKT/NF-κB/TNF 通路防治非酒精性脂肪肝病的機制

張 新 陳文娜 宋 囡 金宏飛 張 琪 何信用 劉雨彤 （遼寧中醫藥大學，沈陽 110000）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確肝臟損傷因素外，以肝細胞脂肪過度堆積、脂肪變性、炎癥細胞浸潤為主要特征的臨床綜合征，其發生發展與胰島素抵抗、氧化應激、炎癥反應等密切相關［1-2］。歷代醫家根據其臨床表現將其稱為“脅痛”“痰濁”“積聚”“肥氣”“肝癖”等［3］。近年全球流行病學調查研究顯示，NAFLD 在全球范圍的發病率為10%～30%，在中國的患病率約為15%，且逐步呈現年輕化趨勢［4-5］。目前臨床上多使用降脂藥物、抗氧化劑和胰島素增敏劑等進行治療，但長期服用這些藥物可能引發嚴重的毒副作用［6］。相對而言，中醫在治療NAFLD 方面具有其獨特的優勢，使得一些中草藥成為治療NAFLD的理想藥物［7］。

丹蔞片主要由瓜蔞、薤白、川芎、丹參、葛根、赤芍、澤瀉、郁金、骨碎補、黃芪10 味中藥組成，以化瘀散結、益氣通陽功效組方。方中澤瀉、葛根、黃芪有保護血管內皮細胞抗氧化應激損傷作用［8-10］；瓜蔞、骨碎補、郁金、薤白有抗動脈粥樣硬化和降脂等作用［11-12］；川芎、丹參、赤芍有降低血液黏度及毛細血管通透性、改善血液流變等作用［13］；同時，丹蔞片集宣痹、通滯、化痰、養血、化瘀、理氣于一體，進而從多角度對NAFLD 進行治療。

本課題組傳承楊關林教授“痰瘀論治”動脈粥樣硬化性疾病學術思想，循證證實“化瘀祛痰”干預冠心病穩定型心絞痛具有提高運動耐量、減少心絞痛發作的作用，并具有良好滯后效應（18 周）臨床價值。該法已被公認為治療冠心病的新方法，被“十二五”“十三五”行業規劃教材《中醫內科學》及《中西醫結合內科學》采納；開創“痰瘀論治”研究新流派。代表藥物丹蔞片（國藥準字Z20050244）為吉林康乃爾藥業有限公司獨家擁有的新藥，是醫保、中保品種，被4 個指南或專家共識推薦應用。丹蔞片自上市臨床應用以來已被大量試驗研究證實對痰瘀互結型疾病療效顯著，可改善該類患者的臨床癥狀，其安全性好，可減少心肌耗氧量，且不良反應少，現已在臨床上廣泛推廣使用［14-17］。但丹蔞片通過干預PI3K/AKT/NF-κB/TNF通路防治NAFLD 的機制在既往研究中鮮有報道，需要利用動物實驗以探索其機制。故本研究通過構建多維分子互作網絡，并應用動物實驗對中藥分子靶標進行驗證，從而為丹蔞片治療NAFLD的作用機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數據庫及在線軟件 PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TCMSP 數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、PharmMapper 數據庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、TTD 數據庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）、DisGeNET 數 據 庫（http：//www.disgenet.org/）、Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）、String 數據庫（https：//string-db.org）、Gene Cards 數 據 庫、（https：//www.genecards.org/）、Cytoscape 3.7.1軟件、Venny2.1軟件［18-24］。

1.1.2 試劑與儀器 丹蔞片（吉林康乃爾藥業有限公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（四川邁克生物科技股份有限公司）；TNF-α、IL-6 檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；腫瘤壞死因子受體相關因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factors 2，TRAF2）、PI3K、p-AKT、NF-κB 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；p-IκBa、p-IKKs 抗體（Abcam 公司）；Tanon 5200 化學發光成像系統（上海天能科技有限公司）；AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）、Tecan Infinite M1000 PRO 多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），全自動蛋白質印跡定量分析系統（普諾森生物科技有限公司）。

1.1.3 實驗動物 SPF級C57BL/6J 雄性小鼠18只，8 周齡，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2012-0001，飼養于全封閉SPF 級狀態下的遼寧中醫藥大學實驗動物中心，保證動物自由進食與飲水。動物實驗經遼寧中醫藥大學動物倫理委員會批準，并按照《實驗動物飼養管理和使用指南》進行。

1.2 方法

1.2.1 丹蔞片化學成分的查找 通過TCMSP 數據庫對丹蔞片全方，即丹參、瓜蔞、川芎、骨碎補、郁金、赤芍、澤瀉、薤白、葛根、黃芪10 味中藥進行檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為條件進行篩選。另外，查閱文獻找到丹蔞片中因上述篩選條件而被剔除但對NAFLD 有潛在研究價值的藥物成分，刪除無靶點的活性成分，篩選得到有效藥物成分。

1.2.2 丹蔞片靶點的篩選及網絡構建 通過Pub-Chem 數據庫、TCMSP 數據庫、PharmMapper 數據庫查找丹蔞片所有潛在的藥物作用靶點，同時利用Uniprot 數據庫，將蛋白種屬設置為“Homo sapiens（Human）”，校正收集的靶點，同時利用Cytoscape 3.7.1軟件構建藥物-活性成分-靶點網絡圖。

1.2.3 NAFLD 靶點的篩選 以“non-alcoholic fatty liver disease”為檢索詞，通過DisGeNET 數據庫、Gene cards 數據庫、TTD 數據庫進行檢索，依據不同數據庫篩選條件，將結果分類并刪除重復數據，獲取NAFLD 的潛在靶點數據集，并利用Uniprot 數據庫校正獲取標準基因名。

1.2.4 藥物疾病共有靶點網絡的構建及映射 將藥物靶點和疾病靶點分別上傳至Venny2.1 軟件繪制韋恩圖，取丹蔞片與NAFLD 靶點交集，將共有靶點以數據文件和屬性文件上傳入至Cytoscape3.7.1軟件，點擊“Tools-NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network”，同時成分和基因按照Degree 排列，利用網絡節點相關拓撲參數構建共有靶點網絡。

1.2.5 PPI 網絡分析 將上述靶點導入STRING 平臺，蛋白種屬設置為“Home sapiens”，選擇“multiple proteins”模式，最低相互作用閾值選擇“highest confidence（≥0.700）”，network display mode 選擇“interactive svg”，network display options 選擇“hide disconnected nodes in the network”，其余參數默認，建立藥物-疾病靶標PPI相互作用網絡。

1.2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析將上述篩選出的PPI 網絡靶點輸入DAVID6.8 數據庫，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“gene list”“Homo sapiens”，然后導出Gene Ontology 的BP、CC、MF及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 中的PATHWAY 進行GO 基因注釋及KEGG 通路分析。按P值（P≤0.01）升序排列，利用Excel 文件及Omic Share云平臺將符合條件的GO 生物過程和KEGG 信號通路進行數據可視化分析。

1.2.7 動物分組及造模 C57BL/6J小鼠18只隨機分為對照組、模型組和丹蔞片組，6 只/組，對照組給予正常飼料喂養，模型組與丹蔞片組給予高脂飼料8周造模，8周后丹蔞片組給藥［680 mg（/kg·d）］4周，劑量按人與動物體表面積折算系數換算，同時對照組與模型組灌胃4周等體積生理鹽水。

1.2.8 血脂水平檢測 眼球采血法收集小鼠血液，3 500 r/min 離心30 min后，采用全自動生化分析儀，按照試劑說明步操作檢測血清血脂LDL-C、HDL-C、TC、TG水平，最后對數據進行統計分析。

1.2.9 全自動蛋白質印跡定量分析系統（Wes）檢測TNF 通路相關蛋白表達 打開Wes 儀器、電腦及Compass 軟件進行自檢。利用RIPA 蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑）提取肝組織蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，使用Antibody Diluent Ⅱ稀釋一抗和二抗，樣品上樣量為4.5 μl，包括0.1×Sample Buffer 與樣品原液共3.6 μl，5×Master Mix 0.9 μl，95 ℃變性5 min。樣品制備后，按照樣品、封閉液、一抗、二抗、發光液及洗液順序加入孔板，上機檢測結束后對結果進行分析處理。

1.3 統計學分析 采用Graphpad Prime 8 軟件進行統計分析，計量數據均以表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹蔞片活性成分 利用TCMSP 數據庫檢索丹蔞片10味中藥，即：丹參、瓜蔞、川芎、骨碎補、郁金、赤芍、澤瀉、薤白、葛根、黃芪，共檢索得到190 個活性成分，刪除重復成分及無效成分后，得到141個有效活性成分，具體見圖1（由于圖中部分成分名稱過長不易展示，具體見表1）。

表1 丹蔞片部分活性成分Tab.1 Some effective active ingredients in Danlou Tablets

2.2 丹蔞片靶點的篩選及網絡構建 利用Pub-Chem、TCMSP、PharmMapper 數據庫篩選丹蔞片所有潛在的藥物作用靶點，并通過Uniprot 數據庫校正，去重后共得到350 個潛在靶點，Cytoscape 3.7.2軟件根據degree 值構建藥物-活性成分-靶點網絡，degree 值越大代表藥物靶點作用力越強。其中青色代表藥物作用靶點，其他顏色代表藥物活性成分（未刪除重復項），見附圖1（www.immune99.com）。

圖1 丹蔞片成分網絡Fig.1 Ingredient network of Danlou Tablets

2.3 疾病靶點的篩選 通過DisGeNET、Gene cards、TTD 數據庫進行檢索，以“non-alcoholic fatty liver disease”為檢索詞，計算Gene cards 數據庫相關性（relevance score）的兩次中位數為13.41，篩選出Relevance score≥13.41 的數據403 個，DisGeNET 數據庫中篩選出Score_gda≥0.1 的數據140 個，TTD 數據庫中篩選出3 個，去重并利用Uniprot 數據庫校正后共得到478 個與NAFLD 相關的潛在疾病靶點，主要包括載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、AKT 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）等，如圖3。

圖3 藥物靶點-疾病靶點韋恩圖Fig.3 Venn diagram of targets of herbs and disease

圖2 疾病靶點網絡Fig.2 Ingredient network of disease

2.4 藥物疾病共有靶點網絡構建及映射 將上述丹蔞片及NAFLD 靶點依次上傳至Venny2.1 軟件，繪制韋恩圖，得到共有靶點115個，其中藍色代表疾病靶點，黃色代表藥物靶點，見圖4。主要涉及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-6、IκB 激酶家族（IκB kinases，IKKs）、沉默調節蛋白1（sirtuin 1，SIRT1）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等。然后將相互作用的蛋白基因導入Cytoscape 3.7.1 軟件進行可視化分析，共得到2 191 條邊，115個節點，聚類系數為0.679，見圖5。

圖4 共有靶點網絡Fig.4 Network of common targets

圖5 共有靶點PPI網絡Fig.5 PPI network of common targets

2.5 PPI 網絡的構建 為進一步明確丹蔞片潛在靶點與NAFLD靶點間的相互作用關系，將上述篩選得到的共有靶基因上傳至STRING 平臺獲得PPI 網絡，共得到邊數955 條，平均節點度值為16.6，平均本地聚類系數為0.536，見圖6。

圖6 KEGG信號通路結果Fig.6 Results of KEGG signaling pathway

2.6 GO 生物過程和KEGG 通路富集分析 將共有核心靶基因上傳至DAVID 6.8數據庫進行KEGG信號通路的富集及GO 基因注釋分析，共得到P＜0.01的KEGG 信號通路93 個，按照P值升序排列篩選出前20 條與NAFLD 相關的通路，主要包括：非酒精性脂肪肝疾病通路、FoxO 信號通路、TNF 信號通路，HIF-1 信號通路、Toll 樣受體信號通路等；然后將上述通路上傳至OmicShare 平臺，進行數據可視化分析，氣泡顏色代表富集顯著性，大小代表與NAFLD相關且參與該通路的基因數目，見圖7；同時得到335 個生物學過程，主要包括炎癥反應、一氧化氮生物合成的正調控、細胞對脂多糖的應答、蛋白質磷酸化的正調控、膽固醇代謝過程、胰島素刺激的細胞反應等；47 個分子生物學功能，主要包括生長因子活性、血紅素結合、氧化還原酶活性、脂質結合等；32 個細胞組分，主要包括細胞外空間、膜筏、細胞質核周區域、受體復合物等，見圖8；進一步對GO生物過程和KEGG 通路按照P值篩選分析，發現TNF 炎癥通路中的PI3K/p-AKT/p-IKKs/NF-κB 通路密切參與NAFLD的發生發展，見圖9。

圖7 丹蔞片調控NAFLD的GO生物過程分析Fig.7 GO biological process analysis of NAFLD regulated by Danlou tablets

圖8 TNF通路過程分析Fig.8 TNF pathway process analysis

圖9 各組小鼠血脂水平Fig.9 Blood lipid levels in each group of mice

2.7 各組小鼠血脂水平比較 與正常組相比，模型組小鼠血清LDL-C、TG和TC水平顯著升高，HDL-C水平降低（P＜0.05）；丹蔞片組干預后可明顯降低模型組小鼠血清LDL-C、TG 和TC 水平，升高HDL-C 水平（P＜0.05），見圖10。

圖10 TNF通路蛋白表達水平Fig.10 Expression levels of TNF pathway proteins

2.8 TNF通路蛋白表達情況 與對照組相比，模型組小鼠肝組織PI3K、p-AKT、p-IκBa蛋白表達水平明顯降低，TRAF2、p-IKKs、NF-κB 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；丹蔞片干預后PI3K、p-AKT、p-IκBa蛋白表達水平呈上升趨勢，TRAF2、p-IKKs、NF-κB蛋白表達水平呈現下降趨勢（P＜0.05），見圖11。

圖11 炎癥因子表達水平Fig.11 Expression levels of inflammatory factors

2.9 各組小鼠肝組織TNF-α、IL-6 的表達情況 模型組肝組織TNF-α、IL-6 炎癥因子表達水平與正常組相比明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），丹蔞片干預后TNF-α、IL-6 炎癥因子表達水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖12。

3 討論

NAFLD 是一種與遺傳易感和胰島素抵抗密切相關的代謝應激性疾病，主要以肝細胞彌漫性脂肪變為特征，中醫將NAFLD 歸屬于“肝癖”“脅痛”“肥氣”“積證”等病證范疇，曾有人在《難經》描述NAFLD：“肝之積，名曰肥氣，在左脅下”［25］。劉中勇認為，食肥甘厚膩之物過剩，滋膩礙胃，脾失健運，水谷精微運化失調，疏泄失常，濕濁內生，聚濕成瘀濁，阻其血脈，血液運行不暢，瘀結于肝，屬本虛標實之證［26］。而丹蔞片即為針對痰瘀互結型疾病的一種中成藥，薤白、瓜蔞皮化痰散結為君藥，赤芍、丹參、川芎、郁金活血化瘀；黃芪可補氣，葛根助黃芪之力，皆使氣助血行化瘀，亦為臣藥；骨碎補、澤瀉、葛根皆為佐藥，郁金、川芎、丹參皆有引經報使的功效，君、臣、佐、使結合，達到攻補兼施，共奏血脈和暢，痰消瘀化，痹宜痛止，標本兼治的目的［27］。

本研究通過網絡藥理學方法發現，丹蔞片可能通過多過程、多通路對NAFLD 發揮調控作用。GO基因注釋分析主要涉及的生物過程包括一氧化氮生物合成的正調控、膽固醇代謝過程、炎癥反應、胰島素刺激的細胞反應、生長因子活性、血紅素結合、氧化還原酶活性、脂質結合等；KEGG 通路分析主要涉及FoxO 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、Toll樣受體信號通路等，本研究發現PI3K、AKT、IKKs、NF-κB 等基因主要富集于TNF 信號通路，而TNF 信號主要調控免疫炎癥反應，下調其表達可抑制脂肪合成和炎癥反應，降低胰島素敏感性，進而改善NAFLD 臨床癥狀［28-30］。同時，張志強等［31］發現丹蔞片不僅能降低IL-6、TNF-α 等炎癥因子水平，同時可以下調MDA 水平、上調SOD 水平，有效減輕肝組織氧化應激損傷程度，抑制NAFLD 的進程。此外，FoxO、HIF-1、Toll樣受體等信號通路也多與氧化應激、炎癥反應等過程相關［32-35］，故推測丹蔞片通過多過程、多通路共同參與抑制炎癥反應、氧化應激等過程進而發揮抗NAFLD作用。

NAFLD 的發病機制尚不明確，普遍認為其發病機制與“兩次打擊”學說相關［36］。而“第二次打擊”主要是指脂肪變性引起細胞內代謝紊亂導致肝細胞損傷和炎癥反應，引起NAFLD 進一步惡化［37］。TRAF2 作為TNF 通路的銜接蛋白，主要激活轉錄因子c-Jun氨基末端激酶信號通路和NF-κB信號通路，參與免疫細胞的調節［38］。NF-κB 是一種轉錄因子，在炎癥進展中發揮核心作用。正常情況下，NF-κB蛋白通過與IκBα蛋白相互作用，以非活性狀態存在于細胞質中。NF-κB 的激活主要通過抑制IKKs 對IκBα 的磷酸化和蛋白酶體的降解，導致NF-κB 的核轉位［39］。調節一系列炎癥相關介質如TNF-α、IL-6的轉錄和合成，可誘發機體產生級聯瀑布式炎癥反應［40-41］。AKT 是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，是信號傳導通路下游重要的靶激酶，通過PI3K的磷酸化調控后進一步使其下游信號傳導細胞因子IKKs 磷酸化［42］。IKK 屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶復合體，一般情況下，NF-κB 與IκB 結合存在于胞質中，炎癥等因素能刺激IKK 活化，活化的IKK 可通過泛素化或磷酸化激活IκB，使之與NF-κB 解離［43］。本課題組研究發現，丹蔞片干預后，模型組PI3K、p-AKT、p-IκBα蛋白表達水平呈上升趨勢，TRAF2、p-IKKs、NF-κB蛋白表達水平呈下降趨勢，同時血脂水平明顯下降，炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著下降，提示丹蔞片可能通過炎癥通路途徑降低血脂水平，進而抑制NAFLD的發生發展。

本研究利用分子互作網絡，預測丹蔞片潛在活性成分作用于NAFLD 的潛在分子機制，結果顯示丹蔞片通過抗炎、調控氧化應激反應、調節脂質代謝等多成分、多通路地發揮抗NAFLD 作用。同時課題組應用動物實驗對中藥分子靶標進一步驗證，研究發現炎癥反應促進NAFLD 的發生發展，為丹蔞片的臨床應用及NAFLD 的臨床研究提供一定的參考價值。