干擾circRNA_002178抑制膠質瘤細胞惡性生物學行為①

高雪亮 張皓翔 程建業 賈培雷 趙亞鵬 （河北省中醫院神經外科，石家莊 050000）

膠質細胞瘤是一種常見的神經上皮組織腫瘤，具有生長快、侵襲性強、預后差、惡性程度高等特點［1］。傳統的治療是通過外科手術結合術后同步放射治療和藥物化療，近年來轉變為致病基因和調控分子的靶向治療［2］。環狀RNA（circRNA）是一種共價閉環結構的非編碼RNA，在生物細胞中廣泛表達［3］。具有普遍性、穩定性、保守性和特異性，隨著分子生物學的發展，研究顯示circRNA 在腫瘤組織中的表達有特異性差異，在腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和轉移中擔任關鍵角色，其不僅可作為腫瘤診斷和預后生物標志物，還可作為治療的潛在靶點，發揮腫瘤抑制因子或啟動因子效應［4］。但未見circRNA_002178 對膠質瘤的影響，因此，本實驗探討干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、炎癥反應的影響，以期為膠質瘤的臨床治療提供實驗參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本 收集2015 年6 月至2019 年1 月進行手術的膠質瘤患者的癌癥組織及癌旁組織25 對（術前未進行放化療治療的患者）。組織標本取材后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。受試者知曉本研究內容并簽署同意書，本研究經河北省中醫院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗細胞 人膠質瘤細胞U-251 購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640 培養基、胎牛血清、青/鏈霉素溶液購自美國Gibco 公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶公司；mRNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自上海研拓生物科技有限公司；Transwell 侵襲小室購自北京優尼康生物科技有限公司；CCK8 細胞增殖試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；AnnexinV-FTTC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Centrebio 公司；Bax、Bcl-2、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等相關抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；IL-6、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-10 試劑盒購自上海酶聯生物公司。

1.1.4 主要儀器 QP-80 二氧化碳細胞培養箱購自濟南鑫貝西生物技術有限公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國Beckmancoulter 貝克曼庫爾特公司；Multiskan GO 酶標儀購自美國Thermo 賽默飛公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機購自湖南湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-1C無菌塵凈化操作臺購自上海尚凈公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取出凍存的U-251 細胞，水浴鍋解凍處理后，轉移至含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素溶液的RPMI1640 培養基中，將細胞懸液置于細胞培養箱中進行培養，培養條件為37 ℃，5%CO2，飽和濕度；當細胞融合度為80%左右時，采用胰蛋白酶消化為單細胞懸液，傳代培養，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染與分組 將膠質瘤U-251 細胞隨機分為空白對照組（Control）、陰性對照組（shRNANC）、干擾組1（circRNA_002178-shRNA1）、干擾組2（circRNA_002178-shRNA2）、干 擾 組3（circRNA_002178-shRNA3）。其中，空白組加等體積培養液，其余各組根據Lipofectamine 2000TM說明書分別進行轉染。

1.2.3 RT-qPCR 檢測 分別取癌組織和癌旁組織的臨床樣本，剪碎研磨成勻漿后，加入1 ml Trizol 試劑提取總RNA，離心后轉移上清液，加入氯仿混勻，室溫靜置3 min 后離心，轉移上清液，加入異丙醇混勻離心后棄上清液，用75%乙醇洗滌，真空干燥后進行逆轉錄，加入相應引物及樣品，采用2-ΔΔCt法計算circRNA_002178的相對表達水平，實驗重復3次。

取轉染處理后的各組細胞，將細胞稀釋至5×104個/ml，置于培養箱中24 h，棄培養液，采用Trizol 試劑提取細胞樣品中的總RNA，進行反轉錄，加入相應引物，采用2-ΔΔCt法計算circRNA_002178和VEGF mRNA 的相對表達水平，實驗重復3 次。circRNA_002178-shRNA1 正 向 引 物：5′-AGCCCGGGAAGGCGGAGAGAG-3′，反向引物：5′-GCTCGGGGGCCCTGTTGG-3′；circRNA_002178-shRNA2 正向引物：5′-CTGAGCTTCGGGGAGCTGAGT-3′，反向引 物：5′-GCTTCGGGGAGCTGAGTGCGT-3′；circ-RNA_002178-shRNA3 正向引物：5′-CCAATGCTACAGTCGTTACG-3′，反向引物：5′-CCGGCTTTAACGTCGACCTG-3′；VEGF 正向引物：5′-ACCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3′，反向引物：5′-ATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTC-3′；GAPDH 正向引物：5′-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3′，反 向 引物：5′-GTACTCAGCGGCCAGCATCG-3′。

1.2.4 CCK8 檢測細胞增殖率 將轉染后的各組細胞以3×103個/孔接種于96 孔板，置于培養箱中培養48 h，加入10 μl 的CCK8 試劑，培養箱孵育2 h后，于450 nm 波長處采用酶標儀檢測各孔的吸光度值，實驗重復3次。

1.2.5 克隆形成法檢測細胞形成率 將轉染后的各組細胞以5×104個/ml 接種于6 孔板，置于培養箱中培養24 h 后，PBS 溶液洗滌細胞2 次，用4%的多聚甲醛溶液固定細胞20 min，棄固定液，0.1%結晶紫溶液染色15 min，洗去染色液，室溫晾干。拍照觀察，軟件計數，并計算克隆細胞形成率，實驗重復3次。

1.2.6 流式檢測細胞凋亡水平 將轉染后的各組細胞以5×106個/孔接種于96 孔板，離心后棄培養基，PBS 洗滌2 次，棄上清液，加入Annexin V-FTTC溶液重懸細胞，避光孵育10 min，離心棄上清液，PI冰盒中避光孵育10 min，洗去染色液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達水平 將轉染后的各組細胞以5×106個/孔接種于96 孔板，加入裂解液處理，離心后收集上清液，BCA 法檢測細胞蛋白液濃度。取待測蛋白與上樣緩沖液孵育，加熱變性后，將蛋白添加至SDS-PAGE 凝膠上樣孔中，調節電壓，進行轉膜、封閉、一抗、二抗等操作，TBST溶液洗滌后，采用ECL 法顯影，并拍照記錄實驗數據，實驗重復3次。

1.2.8 Transwell 檢測細胞侵襲 將基質膠均勻鋪于細胞侵襲小室，置于24孔細胞培養板。在上室中加入細胞培養基（200 μl/孔），培養孵育1 h。將各組膠質瘤細胞接種于上室；在下室中加入400 μl 含胎牛血清的細胞培養基，培養12 h。漂洗固定后，用1%結晶紫染液處理30 min，顯微鏡下觀察侵襲細胞，并拍照記錄。

1.2.9 ELISA 檢測血清炎癥因子IL-6、iNOS、IL-10含量 取各組對數生長期細胞，冰上加入細胞裂解液處理，離心取上清。根據試劑盒說明書操作，分別取50 μl 樣品置于酶標孔板底部，混勻封膜，孵育30 min。甩干并洗滌，重復3 次。加入50 μl 酶標試劑，孵育30 min，洗滌5 次，加入顯色液，避光孵育15 min，加入終止液，于450 nm處檢測吸光度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0 軟件進行分析，選擇單因素方差分析（One-Way ANOVA），數據用表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circRNA_002178 在膠質瘤、癌旁組織及不同shRNA 序列中表達的影響 膠質瘤組織circRNA_002178 表達水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05，圖1A），因此，選用膠質瘤細胞U-251 進行后續實驗。在轉染不同的shRNA 片段后，與Control 組相比，shRNA-NC 組circRNA_002178 表達差異無統計學意義，與shRNA-NC 組相比，3 個干擾組circRNA_002178 表達均明顯降低，其中circ_002178-shRNA2組干擾效果最為明顯（P＜0.05，圖1B）。因此，選擇此組作為后續實驗干擾組。

圖1 circRNA_002178 在膠質瘤、癌旁組織及不同shRNA序列中的表達Fig.1 Expressions of circRNA_002178 in glioma，adjacent tissues and different shRNA sequences

2.2 干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞增殖的影響 與Control 組相比，shRNA-NC 組膠質瘤細胞增殖率差異無統計學意義，與shRNA-NC 組相比，circ_002178-shRNA2 組膠質瘤細胞增殖率明顯降低（P＜0.05，圖2A）；與Control 組相比，shRNA-NC 組膠質瘤細胞克隆形成率差異無統計學意義，與shRNANC 組相比，circ_002178-shRNA2 組膠質瘤細胞克隆形成率明顯降低（P＜0.05，圖2B、C）。提示干擾circ-RNA_002178對膠質瘤細胞的增殖具有抑制作用。

圖2 干擾circRNA_002178對膠質瘤細胞增殖的影響Fig.2 Effect of interference circRNA_002178 on proliferation of glioma cells

2.3 干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞凋亡的影響 與Control 組相比，shRNA-NC 組膠質瘤細胞凋亡率差異無統計學意義，與shRNA-NC 組相比，circ_002178-shRNA2 組膠質瘤細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05，圖3A）；與Control 組相比，shRNA-NC 組膠質瘤細胞Bax/Bcl-2 蛋白表達差異無統計學意義，與shRNA-NC 組 相 比，circ_002178-shRNA2 組 膠 質 瘤細胞Bax/Bcl-2 蛋白表達明顯升高（P＜0.05，圖3B）。提示干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞凋亡率及Bax/Bcl-2 蛋白表達具有促進作用，對細胞具有誘導凋亡的作用。

圖3 干擾circRNA_002178對膠質瘤細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of interference circRNA_002178 on apoptosis of glioma cells

2.4 干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞侵襲的影響 與Control 組相比，shRNA-NC 組膠質瘤細胞中VEGF 蛋白及mRNA 的表達差異無統計學意義；與shRNA-NC 組 相 比，circ_002178-shRNA2 組 膠 質 瘤細胞中VEGF蛋白及mRNA表達明顯降低（P＜0.05，圖4A、B）；與Control 組相比，shRNA-NC 組侵襲細胞數差異無統計學意義，與shRNA-NC 組相比，circ_002178-shRNA2 組侵襲細胞數明顯減少（P＜0.05，圖4C）。提示干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞侵襲具有抑制作用。

圖4 干擾circRNA_002178對膠質瘤細胞侵襲的影響Fig.4 Effect of interference circRNA_002178 on invasion of glioma cells

2.5 干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞炎癥因子的影響 與Control 組相比，shRNA-NC 組膠質瘤細胞炎癥因子表達差異無統計學意義，與shRNA-NC組相比，circ_002178-shRNA2 組膠質瘤細胞促炎因子IL-6、iNOS 水平明顯降低，抗炎因子IL-10 水平明顯升高（P＜0.05，圖5）。提示干擾circRNA_002178對膠質瘤細胞炎癥因子具有抑制作用。

圖5 干擾circRNA_002178對膠質瘤細胞炎癥因子的影響Fig.5 Effect of interference circRNA_002178 on inflammatory factors in glioma cells

3 討論

膠質瘤是具有強侵襲性的惡性腫瘤，患者預后不良，積極治療的中位生存期僅為1年，五年病死率超過95%。當前的治療策略和治療水平上取得了相當大的進步，但臨床結果仍令人遺憾［5］。circ-RNAs 在膠質瘤中差異表達，并與神經膠質瘤分期相關，基于穩定性和circRNAs 的高保守，circRNAs可能是膠質瘤治療的潛在分子靶點［6］。其中，circ-RNA_002178 在促進或抑制腫瘤的發生發展中發揮重要作用，例如circRNA_002178 在肺腺癌中作為ceRNA 促 進PD-L1/PD1 表達［7］；circRNA_002178 通過激活Akt/mTOR 通路促進口腔鱗癌細胞的增殖和遷移［8］；干擾circRNA_002178 抑制COL1A1 表達，從而延緩乳腺癌進展［9］，但circRNA_002178 對膠質瘤的影響尚未明確，因此，本研究對二者的關系進行探討。

細胞凋亡在胚胎發育、功能完善、內環境穩定等方面發揮重要作用；當細胞凋亡功能受到抑制時，將導致腫瘤的發生及免疫功能的異常［10］。因此，抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡具有重要意義，例如，替莫唑胺通過調控促凋亡蛋白Bax及caspase-3的表達上升，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達下降，發揮緩解膠質瘤的作用［11］；過表達RNA SNORD44激活caspase依賴的凋亡途徑，促進細胞凋亡，進而抑制膠質瘤細胞的增殖，侵襲和遷移［12］；干擾circMAN2B2 的表達抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲、遷移，誘導其凋亡，可顯著降低腫瘤大小，緩解病情進展［13］。本研究結果顯示，干擾circ_002178 促進膠質瘤細胞的凋亡率及Bax/Bcl-2 蛋白表達。結果提示，干擾circ-RNA_002178對膠質瘤細胞具有誘導凋亡的作用。

VEGF 能夠誘導單核細胞聚集，抑制內皮細胞凋亡，促進內皮細胞的生長及血管基質的成熟，加速新生血管形成，有利于腫瘤的生長，并誘導癌細胞的侵襲和轉移［14］，因此，VEGF 是惡性腫瘤生長運動的必要條件。BHATTACHARYA 等［15］研究表明，VEGF 信號傳導介導大腸癌細胞的遷移和侵襲；CELLA 等［16］研究顯示，miRNA-451通過靶向CAB39，通過mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲；此外，VEGF 可作為潛在的治療靶點來改善疾病預后，例如在結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等方面［16-19］。本研究結果顯示，干擾circ_002178 可抑制膠質瘤細胞VEGF 蛋白及mRNA 的表達，并減少侵襲細胞數量。提示干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞侵襲具有抑制作用。

炎癥因子是腫瘤微環境的重要組成部分，與腫瘤的發生、發展、轉移和侵襲關系密切［20］。IL-6、iNOS、IL-10 均是生物體內炎癥反應的敏感指標。其中，iNOS 是體內NOS 活性氧自由基產生的催化酶，反映體內的炎癥程度，在病理狀態下作為炎癥介質，參與介導炎癥細胞凋亡等病理生理過程［21］。研究表明，炎癥因子IL-6 和TNF-α 在輔助診斷卵巢癌方面具有較高價值［22］。本研究結果顯示干擾circ_002178 可下調膠質瘤細胞IL-6、iNOS 水平，上調IL-10 水平。提示干擾circRNA_002178 對膠質瘤細胞的炎癥因子具有抑制作用。

綜上所述，干擾circRNA_002178 可抑制膠質瘤細胞的增殖、侵襲、炎癥反應，誘導其凋亡。干擾circRNA_002178 能夠有效抑制膠質瘤細胞的惡性生物學行為，有望成為治療膠質瘤的新靶點。