靈芝酸A多克隆抗體制備及酶聯免疫吸附測定法的建立

袁耀武，田益玲，李升云，楊心怡，馬曉飛

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001）

靈芝通常是指多孔菌科真菌赤芝或紫芝的子實體，在中國傳統醫學中，靈芝是一種名貴的中藥材。由于含有多種功效因子，靈芝往往被加工成干片、粉劑及膠囊等多種保健品，或經過提取制成口服液及醫用注射液等制劑。然而由于生長環境及品種差異，不同來源的靈芝中各種功效因子含量存在較大差異，再考慮加工條件及人為摻假等因素，使得靈芝保健品市場中各類產品魚龍混雜，質量良莠不齊。因此，提供一種能夠衡量靈芝產品質量的快速檢測方法，是本領域技術人員亟需解決的問題。在靈芝的多種功效因子中，靈芝三萜是其中之一，屬于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，化學性質穩定，不易在加工過程中降解。靈芝酸A在靈芝三萜中所占比例最大，是靈芝三萜類標志物之一，而且靈芝酸A具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、緩解哮喘及抗疲勞等多種生物學活性，這些活性基本上能夠體現靈芝在傳統中藥方劑里的功效。基于上述原因，可以將靈芝酸A作為衡量靈芝產品質量的重要指標之一進行精準測定，從而對靈芝產品質量作出快速評估。目前，靈芝酸A的檢測方法有可見光比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法以及色譜-質譜聯用技術。可見光比色法和紫外分光光度法測定靈芝酸A的缺點是特異性及靈敏度均較低，高效液相色譜法和色譜-質譜聯用技術的缺點是儀器專業化程度高，檢測時間和運行成本都比較高。與上述方法相比，酶聯免疫吸附測定法反應條件溫和又具有較高的靈敏度，對儀器專業化要求也不高，在小分子物質定量測定中得到了廣泛的應用。Sakamoto等利用抗靈芝酸A的單克隆抗體，構建了靈芝酸A的酶聯免疫吸附測定法，該方法用于靈芝酸A測定得到了較高的靈敏度。Yusakul等還嘗試制備抗靈芝酸A的單鏈可變區片段，用于構建靈芝酸A的酶聯免疫吸附測定法。酶聯免疫吸附測定法是基于抗原-抗體反應的測定方法，特異性抗體是測定的關鍵因素，單克隆抗體與單鏈可變區片段具備較高的特異性，但是制備過程較為復雜，與上述抗體制備技術相比較，多克隆抗體的制備則相對簡單，然而由于多抗中含有多種獨特型抗體，靶向分散缺乏特異性，如果包被原選擇不當，靶向其他區域的抗體會影響到小分子目標物的檢測。本研究嘗試制備低成本的抗靈芝酸A多克隆抗體，經過靶向分析后，選擇合適的包被原，構建基于多克隆抗體的靈芝酸A酶聯免疫吸附測定法并通過對市場中靈芝樣品的測定驗證其準確性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物

靈芝粉、靈芝孢子粉，來自中國各省市市場。

雞卵清白蛋白、牛血清白蛋白 美國Sigma-Aldrich公司；靈芝酸A 上海源葉生物科技有限公司；酶標板廣州潔特生物過濾股份有限公司；羊抗兔IgG-HRP、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）北京索萊寶科技有限公司；四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF） 上海麥克林生化科技有限公司；1-羥基苯并三唑、,-二異丙基碳二亞胺 上海邁瑞爾化學技術有限公司。

新西蘭大白兔購自河北實驗動物中心，實驗符合動物倫理要求。

1.2 儀器與設備

DNM-9602型酶標儀 北京普朗新公司；WZ80-2微孔板恒溫振蕩器 杭州佑寧儀器有限公司；1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；0.45 μm有機微孔濾膜上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 偶聯蛋白的合成

靈芝酸A與牛血清白蛋白偶聯物（bovine serum albumin-active ester method-ganoderic acid A，BSAAEM-GAA）的合成：采用活化酯法。取牛血清白蛋白500 mg，用8 mL溶解液（2%碳酸氫鈉溶液∶四氫呋喃＝1∶1）溶解。取靈芝酸A 100 mg、1-羥基苯并三唑140 mg、,-二異丙基碳二亞胺140 mg、四氫呋喃1 mL，以上試劑0～5 ℃攪拌1 h，形成活化酯。取上述活化酯溶液總質量的20%至牛血清白蛋白溶液中，室溫反應2～4 h。將溶液冷凍干燥48 h得粉末。將粉末用50 mL純化水溶解，0.45 μm濾膜過濾，除去不溶物，收集濾液。將濾液用3 kDa分子質量截留的滲透膜滲透10 h，每2 h換純化水1 次。將滲透處理后的溶液再次冷凍干燥72 h，得固體粉末，即為BSA-AEM-GAA。

靈芝酸A與雞卵清白蛋白偶聯物（ovalbumin-active ester method-ganoderic acid A，OVA-AEM-GAA）的合成：采用活化酯法，與BSA-AEM-GAA的合成方法相同，將雞卵清白蛋白替換牛血清白蛋白即可。

偶聯物前體BSA-AEM-及OVA-AEM-的合成：與BSAAEM-GAA的合成方法相同，過程中不添加靈芝酸A。

1.3.2 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的制備

選取健康雄性日本大耳白試驗兔兩只，以BSAAEM-GAA作為免疫原，進行4 輪免疫接種，每輪接種質量濃度為2 mg/mL，每次注射0.5 mL。第1輪接種與弗氏不完全佐劑混合使用，采用皮下多點注射，間隔14 d后進行第2、3、4輪免疫接種，采用耳靜脈注射，每輪間隔7 d。第4輪接種7 d后，心臟采血，得到抗靈芝酸A免疫血清，通過A蛋白親和層析柱純化至IgG并濃縮至原始體積，4 ℃保存備用。

1.3.3 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價的測定

采用間接酶聯免疫吸附方法對BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價進行測定。BSA-AEM-GAA作為包被原，包被質量濃度為20 μg/mL。抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體樣本的遞進稀釋梯度為1∶5，各稀釋度做3 個重復孔，1∶100稀釋的陰性樣本作對照。反應于微孔板恒溫振蕩器中進行，一抗與酶標二抗的反應條件均為800 r/min、37 ℃、20 min。顯色底物為TMB工作液，顯色時間10 min。終止顯色后，用酶標儀在450/630 nm雙波長處測定各實驗孔吸光度。讀值大于或等于0.2，且與陰性孔讀值的比值大于等于2.1的結果判斷為陽性孔，陽性孔最大稀釋倍數即為血清效價。

1.3.4 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的靶向分析

分別以BSA、OVA-AEM-GAA、OVA-AEM-、BSAAEM- 4 種物質包被酶標板，包被質量濃度均為20 μg/mL。總效價為1∶78 125的抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體用樣品稀釋液1∶100稀釋，分為3 個組：BSA吸收處理組（多抗溶液中加入等量的質量濃度為2 mg/mL的BSA溶液，振蕩反應1 min）、GAA處理組（多抗溶液中加入等量的質量濃度為20 μg/mL的GAA溶液，振蕩反應1 min）及未處理組（多抗溶液中加入等量的PBST溶液，振蕩反應1 min）。采用間接酶聯免疫吸附法對多克隆抗體進行測定，分析其中抗體的靶向區域，每組做3 個重復孔，1∶100稀釋的陰性樣本作對照，其他反應條件同于1.3.3節。

1.3.5 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體中靈芝酸A特異性抗體效價的測定

OVA-AEM-GAA作為包被原，包被質量濃度為20 μg/mL，其他操作與1.3.3節相同。

1.3.6 方法的建立、劑量反應關系曲線的擬合及標準曲線制備

合成抗原OVA-AEM-GAA經pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至質量濃度20 μg/mL，100 μL/孔包被酶標版，37 ℃反應4 h，反應結束后PBST溶液洗板3 遍。靈芝酸A標準品用樣品稀釋液3 倍遞進稀釋，分為0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24、72、220、660 μg/L及2 000 μg/L 11 個標準劑量組。分別取50 μL各質量濃度的靈芝酸A標準品溶液，加入酶標版對應的標準孔中，每個質量濃度標準品及待測樣品均做3 個孔。抗BSA-AEM-GAA多抗用樣品稀釋液稀釋為靈芝酸A特異性抗體效價為1∶25，向上述各孔中加入多抗溶液50 μL。酶標板置于微孔板恒溫振蕩器中，800 r/min、37 ℃反應20 min，反應結束后PBST溶液洗板3 遍。于上述各孔中加入100 μL 1∶1 000（酶標記物體積∶樣品稀釋液體積）稀釋的羊抗兔IgG-HRP（工作效價為1∶500～1∶2 000），置于微孔板恒溫振蕩器中，800 r/min、37 ℃反應20 min，反應結束后PBST溶液洗板3 遍。于上述各孔中加入100 μL TMB底物工作液，37 ℃反應10 min。反應結束后上述各孔中加入50 μL終止液，用酶標儀在450/630 nm雙波長測定各實驗孔吸光度。計算組內重復孔吸光度的變異系數（coefficient of variation，CV）計算每一劑量組相對吸光度，相對吸光度/%＝/×100，其中，為某一質量濃度靈芝酸A反應孔的平均吸光度，為0 μg/L靈芝酸A反應孔的平均吸光度。通過Excel工具欄中的數據分析選項，進行單因素方差分析，確定吸光度與0 μg/L及2 000 μg/L劑量組差異顯著的劑量組，利用與上述兩個劑量組均差異顯著的劑量組數據繪制相對吸光度與靈芝酸A質量濃度的關系曲線，得到回歸方程并計算靈芝酸A的IC、IC、IC及IC。以IC～IC之間質量濃度作為該測定方法的線性范圍，以IC對應的質量濃度為檢出限。然后將IC與IC之間的質量濃度分5 個劑量組，制備靈芝酸A測定的工作曲線。

1.3.7 可重復性驗證與回收率的測定

稱取0.25 g靈芝孢子粉，置于10 mL樣品管中，加入無水乙醇5 mL，浸泡24 h，離心后收集上清液，用樣品稀釋液5 倍遞進稀釋，取適當稀釋度的試樣液作為待測液，用1.3.6節建立的間接競爭酶聯免疫吸附法進行測定，同時測定靈芝酸A標準品，繪制回歸曲線。根據試樣孔的相對吸光度，在標準曲線上查得試樣液對應的靈芝酸A質量濃度再乘以樣品稀釋倍數則為樣品中靈芝酸A的含量。得到孢子粉中靈芝酸A的含量后，以其含量大約1 倍劑量（70 mg/kg）的靈芝酸A標準品加入到靈芝樣品中，同法處理后進行5 個批次的測定，得出樣品加標回收率。

1.3.8 樣品中靈芝酸A的測定

從市場中收集22 份靈芝粉劑產品：11 種破壁靈芝孢子粉（BGSP1～BGSP11）、6 種靈芝粉（GP1～GP6）及5 種靈芝孢子粉（GSP1～GSP5）。采用1.3.6節及1.3.7節樣品處理及測定方法進行測定，計算靈芝酸A的含量，并進行方差分析。將上述22 種產品采用高效液相色譜法進行靈芝酸A測定，對2 種方法的測定結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價的測定結果

如表1所示，出現陽性反應的最高稀釋度為1∶78 125，效價以出現陽性反應的樣本最高稀釋度表示，因此抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價為1∶78 125，結果說明免疫原的免疫接種取得了成功。總效價是衡量動物對免疫原整體應答效果的指標，并不能反映出針對半抗原的應答效果，針對半抗原的應答效果需要測定半抗原特異性抗體的效價。

表1 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價的測定結果Table 1 Result of determination of total titer of polyclonal antibody against BSA-AEM-GAA

2.2 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的靶向分析

由表2可知，抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體能夠與包被原BSA-AEM-出現陽性反應，而與包被原OVA-AEM-反應陰性，說明其中不存在靶向圖1中3號位的抗體，但是可能存在靶向圖1中1號位及2號位的抗體，與包被原BSA的陽性反應證實了靶向圖1中1號位抗體的存在。經過BSA吸收處理的多抗與包被原BSA的反應陰性，但是與包被原BSA-AEM-的反應依然陽性，也證實了靶向圖1中2號位抗體的存在。抗BSA-AEM-GAA多抗與包被原OVA-AEM-GAA出現陽性反應，但是與OVA-AEM-呈現陰性反應，因此可以推斷多克隆抗體中存在靶向圖1中4號位或5號位的抗體。經過GAA吸收處理的多抗與包被原OVA-AEM-GAA的反應陰性，證實了靶向圖1中5號位抗體的存在，也否定了靶向4號位抗體的存在。因此，在經過靶向分析后，明確了抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體中含有靶向BSA、GAA以及BSA與聯接部結合點等區域的抗體。

表2 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的靶向分析結果Table 2 Target analysis of polyclonal antibody against BSA-AEM-GAA

圖1 抗偶聯抗原的多克隆抗體中各獨特型抗體靶向位置示意圖Fig. 1 Target location of each idiotypic antibody in polyclonal antibody against conjugated antigen

2.3 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體中靈芝酸A特異性抗體效價的測定結果

如表3所示，多抗樣本出現陽性反應的最高稀釋度為1∶3 125。由表3可知，以OVA-AEM-GAA作為包被原，抗BSA-AEM-GAA多抗樣品中只有抗靈芝酸A抗體能夠參與反應，因此抗BSA-AEM-GAA多抗中靈芝酸A特異性抗體效價為1∶3 125。靈芝酸A特異性抗體效價與總效價相比明顯降低，但其含量足以用于靈芝酸A的酶聯免疫吸附測定，說明本實驗對靈芝酸A免疫原的合成獲得成功，其能夠激發動物免疫系統對靈芝酸A足夠的應答強度。

表3 靈芝酸A特異性抗體效價的測定結果Table 3 Results of determination of titer of specific antibody against ganoderma acid A

2.4 劑量反應關系曲線的擬合及線性分析

按照1.3.6節方法采用間接競爭酶聯免疫吸附測定法，靈芝酸A每一劑量組的相對吸光度、組間差異顯著性及CV結果見表4。選取與0 μg/L及2 000 μg/L劑量組吸光度均表現為顯著差異的劑量組（0.3、0.9、2.7、8.1、24、72 μg/L）數據進行曲線擬合，表示相對吸光度，表示靈芝酸A質量濃度，在對數函數模型下，取得較好的擬合效果，回歸方程：＝－15.45ln＋71.424，＝0.988 7。如果軸以靈芝酸A質量濃度的自然對數表示，可以得到線性回歸方程：＝－15.454＋178.17，值相同。計算出靈芝酸A的IC為4.0 μg/L，IC為0.6 μg/L，IC為27.3 μg/L，IC為0.3 μg/L。確定該測定方法的線性范圍（IC～IC）為0.6～27.3 μg/L，檢出限（IC）為0.3 μg/L。經過比較，該法用于靈芝酸A的測定比高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法及免疫層析法具有更低的檢出限，與Sakamoto等構建的酶聯免疫吸附測定法相比，檢出限低1 個數量級，且反應用時更短。

根據線性范圍，將靈芝酸A分為0.6、1.5、4.0、10.5、27 μg/L劑量組，通過間接競爭酶聯免疫吸附測定法，制備出靈芝酸A測定的工作曲線，得到線性回歸方程：＝－16.177＋184.84，表示相對吸光度，表示靈芝酸A質量濃度的自然對數值，值可達0.996 4，表明該工作曲線具有較高的擬合度。

表4 不同質量濃度靈芝酸A的間接競爭酶聯免疫吸附測定結果Table 4 Results of ic-ELISA for ganoderma acid A at different concentrations

2.5 可重復性實驗驗證與回收率實驗結果

樣品加標前后5 批次實驗測定結果見表5，加標樣品與不加標樣品5 個批次測定結果的批間CV均小于10%，樣品加標回收率在82.9%～118.6%之間，不同批次的測定結果說明該方法對樣品中靈芝酸A測定具有較好的重復性，加標回收率結果說明該方法對樣品中靈芝酸A測定具有較高的準確度。

表5 不同批次實驗測定靈芝酸A含量Table 5 Recoveries and intra-batch coefficients of variation of ganoderic acid A from spiked samples

2.6 實際產品中靈芝酸A的測定結果

通過間接競爭酶聯免疫吸附法對22 份靈芝粉劑產品的測定結果見表6。不同品牌靈芝粉劑產品中靈芝酸A含量存在較大的差異，相差可以達到100 倍以上。進一步進行數據分析發現，不同類別的靈芝粉劑產品之間，靈芝酸A含量的差異顯著性有所不同，其中破壁靈芝孢子粉與靈芝孢子粉的組間差異不顯著（≥0.05），而靈芝粉與破壁靈芝孢子粉及靈芝孢子粉的組間差異極顯著（≤0.01），即便是同一類別的產品，不同品牌間的組間差異性也是極顯著（≤0.01），這種結果在靈芝粉、破壁靈芝孢子粉及靈芝孢子粉3 類產品中都存在。

表6 不同品牌靈芝粉劑產品中靈芝酸A含量的測定結果Table 6 Results of determination of ganoderic acid A in different brands of G. lucidum powder

圖2 酶聯免疫吸附測定法與高效液相色譜法測定比較Fig. 2 Comparison of results of ELISA and HPLC for ganoderic acid A

將上述22 種產品采用高效液相色譜法進行靈芝酸A的測定，兩種方法的測定結果對比圖見圖2。經數據分析，酶聯免疫吸附測定法與高效液相色譜法的測定結果相比，相關系數=0.972，由此可見，本實驗所建立的間接競爭酶聯免疫吸附測定法對樣品中靈芝酸A的測定結果具有較高的可信度。

3 討 論

靈芝保健品市場中，同一類別和相同質量的產品，價格可以相差10 倍以上，價格與質量相關性，以及性價比，會讓消費者難以抉擇。本研究選用靈芝酸A作為評估靈芝產品質量的檢測指標，是考慮到靈芝酸A在不同品種的靈芝中普遍存在，在靈芝三萜中占有比例最大、穩定性好，而且其經過驗證的抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、緩解哮喘及抗疲勞等多種生物學活性基本上可以代表靈芝的功效。然而，靈芝的功效因子不止一種，某種藥效的作用或許是多種因子共同作用的結果，所以單獨用靈芝酸A作為評估靈芝產品質量的指標有不完善之處。當前靈芝酸A測定還主要是依賴高效液相色譜等專業化的分析儀器，運行成本及技術要求都比較高，酶聯免疫吸附測定法是基于抗原-抗體反應的測定方法，反應條件溫和又具有較高的靈敏度，對儀器專業化要求也不高，而且能夠開發出商業化試劑盒，便于基層的應用，所以利用酶聯免疫吸附法測定靈芝酸A是一個可以考慮的選項。在酶聯免疫吸附法中特異性抗體是測定的關鍵因素，如果需要測定的物質為半抗原，由于本身沒有免疫原性，半抗原需要與載體聯接才能合成免疫原獲得抗體，因而在針對小分子半抗原的多克隆抗體中，往往含有多種獨特型抗體，這些抗體的靶向位置理論上可以分布于免疫原的載體蛋白、載體蛋白與聯接部的結合點、聯接部、半抗原與聯接部的結合點及半抗原5 個區域。在酶聯免疫吸附測定法中，只有靶向半抗原的抗體才是測定目標物所必需抗體，如果包被原選擇不當，多抗中靶向其他區域的抗體與包被原反應會影響到測定的靈敏度或者使測定不能開展。在做小分子目標物酶聯免疫吸附測定時，通常是將包被原與免疫原采用不同的載體，往往就能夠得到理想的效果，然而如果多抗中存在靶向與聯接部有關的抗體，只更換載體則無法保證實驗的正常進行，這也是本實驗中遭遇失敗的經驗總結，所以多克隆抗體的靶向分析有一定的必要性。在抗體制備技術中，單克隆抗體與基因工程抗體具有更高的技術含量，但是在酶聯免疫吸附測定法中，只要包被原選擇合理或者多抗經過適當處理，利用多克隆抗體構建的測定方法在靈敏度與特異性方面并不低于單抗與基因工程抗體，而且具有更低的成本。

4 結 論

利用活化酯法合成BSA-AEM-GAA作為免疫原，接種實驗兔獲得了兔抗BSA-AEM-GAA的多克隆抗體，經過對多克隆抗體總效價及靈芝酸A特異性抗體效價的測定，證明免疫原的合成及動物免疫接種都獲得了成功。本研究還利用多克隆抗體構建了靈芝酸A測定的間接競爭法酶聯免疫吸附法，對所構建測定方法的可重復性、樣品回收率進行測定，結果證明該方法對樣品中靈芝酸A測定具有較好的可重復性和較高的準確度。本研究利用構建的間接競爭酶聯免疫吸附法對市場上22 份靈芝粉劑產品進行測定，測定結果與高效液相色譜法結果具有較強的相關性，證明該方法用于靈芝酸A的測定具有較高可信度。上述結果表明本研究構建的方法用于靈芝酸A測定具有可行性，該方法能夠為靈芝保健品市場中相關產品的質量監控提供一種輔助手段。