復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移侵襲和周期的影響

瘢痕疙瘩是一種組織在創傷或感染后過度修復、纖維化的良性腫瘤，其病理進展與瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、遷移、侵襲的調控異常有關

。有研究表明，復方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖，其作用機制可能與抑制Smad2連接區和Smad3連接區磷酸化有關

。復方芪參提取物可能通過調控TGF-β/Smad信號傳導通路抑制兔耳瘢痕增生

。復方芪參提取物通過抑制肝纖維化和PAI-1mRNA的表達而阻礙肝細胞癌發展

。但復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移侵襲和細胞周期的影響鮮有研究。故本次對此進行研究。

拌和站的混合料拌和能力應與混合料攤鋪速度相匹配，在瀝青混合料攤鋪時，應保證攤鋪機前始終有4～5輛自卸卡車等待卸料。混合料在運輸過程中，為防止溫度下降過快，影響長大縱坡試驗段路面攤鋪、壓實質量，最好在自卸式卡車上覆蓋一層油氈布，同時盡可能加快車輛在運輸時的速度，以減少混合料熱量的散發。

1 材料和方法

1.1 材料：瘢痕疙瘩成纖維細胞（筆者醫院外科手術切除的瘢痕組織離體標本）。

1.2 藥物和主要試劑：中藥材丹參（安徽省亳州市藥材市場）；DMEM培養基（Gibco，美國）；1%青霉素鏈霉素抗生素（Thermo Fisher，美國）；胰蛋白酶和10%胎牛血清（Thermo Fisher，美國）；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗（艾美捷科技，武漢）；RIPA裂解液、PVDF膜（ThermoFisher，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，上海）；CO

細胞培養箱（Thermo，美國）；MTT試劑盒（生物工程股份有限公司，上海）；兔抗人細胞周期蛋白1（Cyclin D1）抗體、VEGF抗體、MMP9抗體、p53蛋白抗體（Santa Cruz，美國）；BIO-RAD Powerpac Universal通用型電泳儀（伯樂，美國）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及分組：將瘢痕疙瘩成纖維細胞轉移至5 ml EP管中，并加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培養液，將兩者混勻，并放于離心機中進行離心（1 000 rpm，5 min），棄掉上清液，對細胞沉淀進行收集，之后加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培養液并吹打混勻，以適當密度接種于新的培養皿中，放置于培養箱中（37℃、5% CO

）進行孵育。待細胞密度到達80%以上時，進行傳代，當細胞密度達到80%以上時，棄去舊培養基，之后用3 ml的PBS緩沖液沖洗2～3次，將剩余的PBS緩沖溶液吸去，再加入1 ml的胰酶在37℃培養箱中進行消化，待細胞變圓，相互分離時，立即加入新鮮培養液2 ml終止消化，吹打成細胞懸液并吸取到5 ml EP管中，將其放于離心機中進行離心（1 000 rpm，5 min），倒掉上清液，對細胞沉淀進行收集，加入新鮮培養液2 ml配制成細胞懸液，吹打混勻以適當密度接種至新的培養皿中，之后對培養皿外表面進行消毒，放入培養箱中進行孵育。后續將瘢痕疙瘩成纖維細胞培養于復方芪參提取物的DMEM培養基中，以維持耐藥性。將瘢痕疙瘩成纖維細胞分為對照組、低濃度組，中濃度組及高濃度組

。

1.3.2 MTT檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞活力：取對數生長期的瘢痕疙瘩成纖維細胞，將各組瘢痕疙瘩成纖維細胞接種于96孔板中，每孔加入200 μl的細胞懸液，細胞貼壁后，加入復方芪參提取物進行處理。將復方芪參提取物設為3個不同濃度(10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L)，與細胞進行共培養48 h后，每孔加入20 μl的MTT試劑，置于恒溫培養箱中繼續培養4 h，之后使用酶標儀檢測波長為490 nm處的吸光度（OD）值

。細胞增殖抑制率（%）=（OD

-OD

）/OD

×100%。

2.4 復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表達的影響：Western blot結果可知，與對照組相比，低、中及高濃度組瘢痕疙瘩成纖維細胞VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表達水平明顯下降，差異有統計學意義（

＜0.05）。見圖3，表4。

2.3 復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞周期的影響：與對照組相比，低、中及高濃度組在G0/G1期的阻滯率明顯上升，S期的阻滯率明顯下降，G2/M期的阻滯率上升，差異均有統計學意義（

＜0.05）。由于G0/G1期細胞占比較高，因此復方芪參提取物主要通過增加G0/G1期細胞阻滯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的周期進展。見圖2，表3。

1.3.5 瘢痕疙瘩成纖維細胞周期進程檢測：將瘢痕疙瘩成纖維細胞接種到12孔板中，細胞接種密度為1.5×10

個細胞/孔，細胞培養24 h后，分為對照組、低濃度組，中濃度組及高濃度組，每個組設置3個復孔，使用乙醇（75%）固定瘢痕疙瘩成纖維細胞，用RNA酶進行處理，用10 μg碘化丙啶進行染色。為了進行S相分析，使用50 μM的溴脫氧尿苷培養細胞3 h。固定后，對鹽酸處理覆蓋物，并進行免疫熒光處理。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，然后檢測各組HepG2.2.15細胞的周期阻滯率

。

式中：Si為某污染物的污染指數；Ci為某污染物的實測濃度，mg/L；C0為某污染物的評價標準值，mg/L.

1.3.4 Western Blot檢測復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞中VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表達的影響：將對數生長期細胞以2×10

個/瓶接種于培養皿中，培養至傳代時，使用預冷的PBS洗滌3次，向每組加入150 μl的RIPA裂解液，對細胞進行均勻吹打，放置于4℃搖床上裂解15 min，之后將細胞刮下，經超聲振蕩離心后提取總蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒進行定量，對上樣緩沖液均勻混合后，取40 μg蛋白進行上樣后，進行SDS-PAGE電泳（1.5 h，250 mA），于室溫下封閉1 h。分別加入抗體VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53（1:1 000），經TBST沖洗3次后，加入HRP標記的羊抗兔1gG二抗（1:2 000），室溫下孵育1.5 h，進行顯影。用目的蛋白條帶和內參吸光度（A）值的比值表示目的蛋白水平

。

日本雕塑家新宮(SusumuShingu)是一位自上世紀70年代以來一直活躍在動態雕 塑領域的藝術家，他的作品大都從大自然中來。他是一位仍然堅持用最簡單、 原始的一套動態藝術原理制作動態雕塑的藝術家。并且，與考爾德雕塑的強大自然動力形式不同的是新宮晉的動態雕塑中所體現出的“自然哲思”（見圖6）。

2 結果

2.2 復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移和侵襲的影響：Transwell檢測可知，與對照組比較，隨著復方芪參提取物濃度的增加，低、中及高濃度組細胞遷移數逐漸降低，細胞侵襲數降低，差異均有統計學意義（

＜0.05）。見圖1、表2。

2.1 復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響：見表1，MTT檢測結果可知，復方芪參提取物處理瘢痕疙瘩成纖維細胞48 h后，隨著復方芪參提取物濃度的增加，細胞的增殖抑制率逐漸升高，差異有統計學意義（

＜0.05），表明復方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。

3.借鑒存款保險制度。退押準備金制度只能保證共享租賃企業正常運營時的退押順利。共享租賃公司作為新型經濟主體，本身就存在較大風險，打去年以來，已有多家共享單車企業倒閉。倒閉公司的押金退回風險已經發生。因此為避免公司倒閉帶來的押金風險，我們依然可以借鑒銀行業的存款保險制度，由共享單車企業為押金投保，一旦發生公司倒閉，由保險公司分擔風險。

1.3.3 Transwell檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞侵襲能力：將24孔的Transwell室上腔室底部預涂基質，將1×10

個瘢痕疙瘩成纖維細胞接種于上室，用無血清DMEM培養基培養。將細胞培養液與含15%胎牛血清的新鮮DMEM培養液1:1混合加入下腔室。細胞培養24 h后，用10%甲醇固定細胞，用0.1%結晶紫染色。最后，在顯微鏡下觀察染色后的細胞

。

3 討論

瘢痕疙瘩是由皮膚組織受損后異常愈合引起的，主要是因為成纖維細胞異常增殖從而導致細胞膠原分泌量增加，進而使得結締組織增生或變形為瘢痕，瘢痕疙瘩形成已經嚴重影響到患者的身心健康，目前，在臨床上主要使用手術、藥物以及激光等治療技術，但是治療效果不理想，復發率高

。研究表明促進成纖維細胞發生調亡，抑制細胞增殖，可以有效改善瘢痕疙瘩

。因而根據瘢痕疙瘩的分子機制，尋找出治療靶點來提高治療效果及降低復發率至關重要。

2.4.3 不同年齡的醫務人員院感知識認知正確率比較分析 按年齡段分析醫務人員院感知識認知正確率發現，30歲以上的醫務人員對問卷的總體認知正確率要顯著高于30歲以下的醫務人員，差異有統計學意義（P＜0.05）。逐一對問卷的7個方面進行分析，可知不同年齡段的醫務人員在傳染病認知、院感傳播知識認知、治療過程防護認知、操作相關知識認知等正確率上差異均有統計學意義（P＜0.05），且31～50歲年齡段的醫務人員普遍具有較高的認知正確率，見表3。

復方芪參提取物屬于中藥復方制劑，由中藥丹參以及黃芪所提取的有效成分黃芪總苷、黃芪多糖和丹酚酸按一定的比例組成。丹參具有化瘀散結的功效，黃芪具有斂瘡生肌功效，兩者均能夠治療肝纖維化、病理性瘢痕等疾病

。本課題通過體外實驗表明，復方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞作用48 h后，隨著復方芪參提取物濃度的增加，低、中及高濃度組細胞的增殖抑制率逐漸升高，細胞遷移數以及侵襲數逐漸降低。表明復方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖，削弱瘢痕疙瘩成纖維細胞發生侵襲與轉移的潛能。本實驗結果與文獻報道結果一致

。

病理性瘢痕中，成纖維細胞過度增殖是導致瘢痕形成的主要環節，多種凋亡抑制基因與促凋亡基因參與成纖維細胞的增殖和凋亡過程，Bax和Bcl-2均作為Bcl-2家族成員，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2能夠抑制凋亡，兩者相互作用從而影響細胞凋亡過程

。在病理性瘢痕中，細胞凋亡基因受到抑制，細胞調控周期變短，促進細胞增生，促進瘢痕形成

。研究表明Cyclin D1是G1期細胞增殖信號的關鍵蛋白，抑制增生瘢痕中Cyclin D1的表達并可通過與細胞周期依賴蛋白激酶（CDK4/6）結合形成復合物從而阻滯細胞周期，促進細胞增殖

。本實驗研究，與對照組相比，低、中及高濃度組在G0/G1期的阻滯率明顯上升，S期的阻滯率明顯下降，G2/M期的阻滯率上升，瘢痕疙瘩成纖維細胞相關蛋白表達水平明顯下降。本實驗結果與文獻報道結果一致

。

綜上，復方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，降低瘢痕疙瘩成纖維細胞發生侵襲與轉移的潛能。

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