骨髓基質干細胞基于p38MAPK通路對大鼠皮膚創傷修復的干預

皮膚是人體的第一道防線，可抵御病菌的侵襲，保護機體組織器官

。輕度、小范圍的皮膚創傷，可自身修復愈合，皮膚創傷修復是皮膚組織離斷或缺損后愈合的過程，包括組織再生、瘢痕組織形成等，涉及多種細胞協同作用

。大量研究顯示，大面積的皮膚創傷不僅修復時間長，且易感染、易形成瘢痕，給患者帶來極大痛苦

。骨髓基質干細胞屬于中胚層細胞，取材容易，易分離培養，具有高效自我修復的功能

。有學者研究發現，骨髓基質干細胞可通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路活性，抑制炎癥因子的表達，促進皮膚創傷修復。本研究設計實驗，建立皮膚創傷大鼠模型，分析骨髓基質干細胞對皮膚創傷模型大鼠p38 MAPK通路的影響，旨在探討骨髓基質干細胞是否通過p38 MAPK通路干預創傷皮膚的修復、鎮痛。

學齡前兒童是中耳炎的高發人群［1］，是這一年齡段兒童聽力損失的主要原因。聲阻抗測試在分泌性中耳炎的診斷上具有很好的靈敏度和特異度［2］。采用聲導抗篩查，不需要兒童的配合、檢查結果具有客觀、準確、快速的特點，是目前理想的群體聽力篩查方法。本研究對沈陽地區十家市管幼兒園4 028名學齡前兒童進行了聲導抗聽力篩查。了解掌握聲阻抗異常鼓室圖發生率，提出相應的干預措施，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料：選取30只Wistar雄性大鼠[河南中檢檢測技術有限公司，使用許可證號：SYXK（豫）2018-0006]，年齡4～7個月，平均年齡（5.5±1.2）個月；體重268～295 g，平均體重（281.5±10.8）g。在相對濕度45%～70%、溫度（21.2±2.5）℃的環境中適應性喂養1周。本研究嚴格按照動物實驗倫理要求操作，且通過廣東省人民醫院倫理委員會審批同意。

1.2 試劑：小鼠抗兔IL-6抗體（Sigma公司）、小鼠抗大鼠TNF-α抗體（Invitrogen公司）、兔抗大鼠hs-CRP抗體（Hyclone公司）、兔抗小鼠CD8

抗體（Gibco公司）、大鼠抗小鼠CD4

抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、大鼠抗兔p-ERK、p38 MAPK抗體（BD公司）。

1.3 方法

(5) 如果配變狀態無電,則根據配變與分支線的關聯關系,取回該分支線下的所有配變以及分支線開關的狀態;

1.3.2 分組及建模：從選取的30只Wistar雄性大鼠中隨機抽取10只作為正常組，剩余20只大鼠建立皮膚創傷模型。實驗前給大鼠脫毛，將大鼠固定于手術臺，消毒，在脊柱1 cm處，切除2 cm×2 cm的皮膚，簡單包扎，建立大鼠皮膚創傷模型，建模過程中大鼠死亡1只，剩余19只大鼠隨機分為創傷組9只，骨髓基質干細胞組10只。骨髓基質干細胞組大鼠創傷部位注射骨髓基質干細胞，創傷組、正常組大鼠不做處理，2周后，觀察大鼠各項指標的變化。

（e）密碼管理：由統一用戶身份管理系統統一接管用戶在其他應用系統中的賬戶和密碼信息，密碼策略按照企業保密規定統一執行。采用統一密碼的方式，即企業門戶密碼與其他應用系統密碼保持一致，在企業門戶中集成用戶的密碼管理模塊，用戶將企業門戶密碼更改后，接口會把新密碼同步到各應用系統中。

1.4.1 大鼠創口愈合率檢測：數碼相機采集未愈合面積圖像，使用Image J軟件測量大鼠傷口面積，計算愈合率。愈合率（%）=[（原始創傷面積-未愈合面積）/原始面積]×100%。

［1］周則明,胡友彬,張鵬,等.面向對象程序設計教學實踐中的問題探微[J].教育教學論壇,2016(8):209-210.

1.4.2 HE染色和再生上皮厚度檢測：斷頸處死正常組、創傷組、骨髓基質干細胞組大鼠，取全部創傷部位及周邊6 mm全層組織，置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋備用。取包埋的皮膚組織，脫蠟，切片，蘇木精染色5 min，沖洗，70%、90%酒精脫水10 min，伊紅染色2 min，酒精脫水，樹膠封片，置于光學顯微鏡（寧波億流信息科技有限公司；型號：Auto-MS500）下觀察創傷皮膚組織變化。隨機選取創傷組及骨髓基質干細胞組大鼠切片各3片，置于光學顯微鏡下觀察，測量再生上皮厚度，取平均值。

1.4.4 酶聯免疫吸附法檢測IL-6、TNF-α、hs-CRP水平：各組大鼠麻醉后，腹主動脈取血，2 000 r/min離心20 min，離心半徑8 cm，分離血清-30℃保存。包被緩沖液稀釋待測血清，每孔加0.3 ml待測血清，37℃靜置2 h，移去包被液，洗滌液沖洗3次，每孔加生物素化抗體，37℃靜置1 h，洗滌，每孔加酶標抗體，37℃靜置1 h，每孔加底物液，室溫靜置0.5 h，每孔加終止劑，使用酶標儀（濟南駿馳生物科技有限公司；型號：ST-360），測定IL-6、TNF-α、hs-CRP水平。

1.4.3 大鼠機械痛閾值、熱痛閾檢測：電子測痛儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司；型號：BIO-EVF4&5）觸壓大鼠創傷部位，測定機械痛閾值。將大鼠置于玻璃容器中，熱板測痛儀（上海益聯醫學儀器發展有限公司；型號：RCY-2）輻射源瞄準創傷部位，測量大鼠的熱痛閾。

在分析壓鉚件的幾何結構和材料特性的過程中使用了下面幾個假設[3]：壓鉚螺母和預置孔在壓鉚過程中各個位置的變形都是與中心軸對稱的，忽略壓鉚螺母內螺紋，建立二維軸對稱參數化模型；壓鉚螺母和連接板件的材料都滿足各向同性，且發生塑性變形時，材料滿足各向同性強化準則。

1.4.5 流式細胞儀檢測CD8

、CD4

水平：待測血清做抗凝處理，分別加入20μl CD8

、CD4

單克隆抗體，室溫孵育30 min，加融血劑，離心，棄上清液，洗滌液充分清洗，加100μl固定劑，加PBS制備為懸液，流式細胞儀（廣州吉源生物科技有限公司；型號：CyFlow Cube6）檢測CD8

、CD4

水平。

1.4.6 Western blot法檢測p-ERK、p38MAPK蛋白相對表達量：使用細胞裂解液裂解樣品，測定蛋白濃度，加配置好的SDS-PAGE凝膠，沸水加熱3 min，使充分蛋白變性，冷卻至室溫，電泳，將PVDF膜轉模30 min，將蛋白膜置于Western洗滌液中漂洗2 min，加封閉液，4℃封閉60 min，加入一抗，孵育1 h，回收一抗，洗滌，加入二抗，孵育1 h，回收二抗，洗滌，超敏ECL發光液（上海炎熙生物科技有限公司）檢測p-ERK、p38MAPK蛋白表達。

2.6 各組大鼠p-ERK、p38MAPK蛋白相對表達量對比：如表5、圖2所示，與正常組比較，創傷組、骨髓基質干細胞組大鼠p-ERK、p38MAPK表達較高，差異具有統計學意義（

＜0.05）；與創傷組比較，骨髓基質干細胞組大鼠p-ERK、p38MAPK表達較低，差異具有統計學意義（

＜0.05）。

2 結果

2.1 各組大鼠皮膚創口組織病理學觀察：如圖1所示，與正常組大鼠（圖1A）比較，創傷組大鼠（圖1B）皮膚創口組織有嚴重的炎癥浸潤現象，新生上皮組織較厚；與創傷組大鼠比較，骨髓基質干細胞組（圖1C）大鼠皮膚創口組織炎癥浸潤明顯好轉，新生上皮組織接近正常皮膚。

2.2 各組大鼠創口愈合率、再生上皮厚度比較：如表1所示，與正常組比較，創傷組、骨髓基質干細胞組大鼠再生上皮厚度較厚，差異具有統計學意義（

＜0.05）；與創傷組比較，骨髓基質干細胞組大鼠創口愈合率較高，再生上皮厚度較薄，差異具有統計學意義（

＜0.05）。

2.4 各組大鼠炎癥因子水平比較：如表3所示，與正常組比較，創傷組、骨髓基質干細胞組大鼠IL-6、TNF-α、hs-CRP水平較高，差異具有統計學意義（

＜0.05）；與創傷組比較，骨髓基質干細胞組大鼠IL-6、TNF-α、hs-CRP水平較低，差異具有統計學意義（

＜0.05）。

2.3 各組大鼠機械痛閾、熱痛閾比較：如表2所示，與正常組比較，創傷組、骨髓基質干細胞組大鼠機械痛閾、熱痛閾水平較低，差異具有統計學意義（

＜0.05）；與創傷組比較，骨髓基質干細胞組大鼠機械痛閾、熱痛閾水平較高，差異具有統計學意義（

＜0.05）。

采用接近于樁基實際工作條件的載荷來確定樁基承載力的方法就是靜載實驗法。在實驗過程中，采用壓重平臺反力裝置對單樁承載力進行檢測，通過觀測靜力載荷測試下的載荷數值，讀取傳感器上荷載沉降和反彈數據來進行實驗數據采集，經過反復實踐，并持續增壓，達到一定情況后停止荷載的增加，如實記錄實驗數據。

1.4 指標檢測

2.5 各組大鼠免疫因子水平比較：如表4所示，與正常組比較，創傷組、骨髓基質干細胞組大鼠CD8

、CD4

水平較低，差異具有統計學意義（

＜0.05）；與創傷組比較，骨髓基質干細胞組大鼠CD8

、CD4

水平較高，差異具有統計學意義（

＜0.05）。

1.3.1 骨髓基質干細胞分離、培養：取備用大鼠斷頸處死，無菌條件下取出股骨、脛骨，DMEM培養基清洗骨髓腔，反復吹打制成懸液，離心，棄上清液，加裂解液，離心，加含10%FBS的培養基懸浮細胞，37℃飽和濕度下培養1周，加0.25%胰酶消化，離心，清洗，加PBS重懸細胞，孵育30 min，離心收集細胞，漂洗，再次重懸細胞至完全離散，室溫孵育10 min，加終止液，孵育5 min，加DMEM完全培養基，離心，轉移細胞，清洗，制成細胞懸液，以供后續實驗使用。

3 討論

皮膚組織是人體的保護屏障，可隔絕機體與外部環境，若皮膚受創傷后不能及時修復，創傷部位易發生感染

。瘢痕是創傷愈合后的產物，若瘢痕過度，可引起外形及機體功能異常，給患者健康產生極大影響

。近年來，隨著我國社會的發展，皮膚創傷發生率呈上升趨勢，因此，尋找有效的治療方法至關重要

。

創口愈合率、再生上皮厚度是判定皮膚創傷修復的指標，皮膚創傷大鼠模型創口愈合率越高、再生上皮厚度越厚，表明其皮膚組織的修復程度越好

。機械痛閾、熱痛閾用于評價鎮痛效果，大鼠承受機械痛閾、熱痛閾時間越長，說明鎮痛效果越好

。本研究表明，使用骨髓基質干細胞處理大鼠，能有效提高創口愈合率，減少瘢痕的生成，提高鎮痛效果，可能與骨髓基質干細胞可促進皮膚與血管再生有關。

藥學專業是技術性非常強的專業，旨在培養學生掌握藥學基本理論和專業技能，使其具備從事藥品生產、質量檢驗、藥物調劑、合理用藥等能力。藥學專業校企合作共同培養高素質應用型人才是國家教育發展的需要，也是學生自身職業發展的需要，該培養模式已成為應用型藥學人才培養的主導模式[1～3]。校企合作在雙贏基礎上長效發展，對于學校而言，學生在實習過程中，通過企業生產環境和文化的熏陶，加強了其職業人格和職業素質培養，為今后順利就業打下堅實基礎；對企業來說，可以有效地為企業儲蓄一批優秀的技能型人才，以實現企業長足發展。鑒于此，藥學專業校企合作應怎樣緊密對接，共同培養高素質應用型人才，是我們急需探索和實踐的問題。

骨髓基質干細胞又稱骨髓間充質干細胞，在特定條件下，可分化為心肌細胞、軟骨細胞、上皮細胞等，還可用于軟骨損傷、心肌損傷、皮膚創傷等的修復

。有學者研究表示，骨髓基質干細胞可調節皮膚創傷大鼠CPR、IL-10水平，提高創口愈合率，可能是骨髓基質干細胞可促進血管內皮細胞、上皮細胞等處分泌傷口愈合所需因子，從而調控對創傷的修復

。據相關研究顯示，骨髓基質干細胞可調控CD4

、CD8

等免疫因子水平，改善機體免疫力，從而保護皮膚組織細胞，促進皮膚功能修復

。本研究表明，使用骨髓基質干細胞處理后的皮膚創傷大鼠，炎癥反應得到改善，免疫功能提升。可能與骨髓基質干細胞具有較強的更新與分化潛能，抑制促炎因子分泌，促進組織及損傷的再修復等有關。此外，骨髓基質干細胞還可調控免疫細胞的增殖、分化，從而減輕炎癥反應，抑制皮膚組織進一步損傷，促進皮膚創傷的修復。

p38MAPK通路是信號轉導中的信號分子，可調節細胞分型及凋亡

。p-ERK可介導Elk-1、Ap-1的轉錄，參與細胞形態維持、骨架構建等；p38MAPK是一類保守的蛋白激酶，可參與細胞的分化、凋亡

。相關研究顯示，皮膚創傷大鼠經骨髓基質干細胞干預后，p38MAPK、p-ERK表達降低。可能是骨髓基質干細胞可抑制p38MAPK通路蛋白活性，促進上皮組織細胞的發育、增殖，從而促進皮膚組織修復

。本研究中，欲進一步探究骨髓基質干細胞對大鼠皮膚創傷的干預效果，擬認為p38MAPK通路與骨髓基質干細胞修復大鼠的皮膚創傷相關。結果顯示，經骨髓基質干細胞干預后由p38MAPK介導的信號通路明顯被抑制，因此推斷，骨髓基質干細胞可通過p38MAPK信號通路抑制p38MAPK、p-ERK通路蛋白活性，抑制IL-6、TNF-α、hs-CRP的合成，阻止皮膚細胞程序性凋亡，減輕皮膚組織損傷，保護皮膚組織。

雖然本研究顯示，骨髓基質干細胞可能通過p38MAPK抑制通路蛋白活性，減輕皮膚組織損傷，但目前臨床并沒有研究證實骨髓基質干細胞、p38MAPK通路與皮膚創傷的聯系，且本次研究選取例數較少，有一定的局限性。因此，本研究結果需進一步被證實，以期為臨床皮膚創傷的診治提供新方向。

綜上所述，使用骨髓基質干細胞對皮膚創傷大鼠進行干預，可緩解大鼠炎癥反應，改善機體免疫力，提高創口愈合率，其作用機制可能與骨髓基質干細胞可抑制p38 MAPK通路活性相關。

[1]梁衛,董國剛,劉梅,等.創傷生肌水凝膠對動物皮膚創傷的愈合作用[J].東南國防醫藥,2021,23(2):117-121.

[2]楊發明,林海生,秦小明,等.牡蠣酶解產物促進皮膚軟組織創傷愈合的作用[J].上海海洋大學學報,2020,29(4):632-640.

[3]陸美,夏育民.TWEAK/Fn14信號在皮膚急性創傷愈合中的作用[J].中國皮膚性病學雜志,2020,34(3):324-328.

[4]李鵬遠,郭海霞,白朝.皮膚創傷后無瘢痕愈合的研究進展[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志,2020,19(2):193-195.

[5]胡曉剛.改良美容縫合法對急診面部皮膚軟組織損傷切口愈合、瘢痕產生及美學效果影響[J].中國傷殘醫學,2020,28(3):8-10.

[6]汪艷,金瓊,陳威,等.Antagomir-30d對大鼠骨髓基質干細胞成骨分化的影響[J].溫州醫科大學學報,2021,51(6):478-482.

[7]Tomic-Canic M,Burgess J L,O'Neill K E,et al.Skin microbiota and its interplay with wound healing[J].Am J Clin Dermatol,2020,21(Suppl1):36-43.

[8]陳薇,蔡航.激光技術對創傷后皮膚瘢痕的康復治療的分析[J].中西醫結合心血管病電子雜志,2020,8(21):189.

[9]尼瑪歐珠,平措羅布,李三旦,等.負壓封閉引流技術治療四肢創傷皮膚修復患者的效果及其對創面細菌耐藥性的影響[J].西部醫學,2019,31(4):575-579.

[10]Di Domizio J,Belkhodja C,Chenuet P,et al.The commensal skin microbiota triggers type I IFN-dependent innate repair responses in injured skin[J].Nat Immunol,2020,21(9):1034-1045.

[11]溫玉瑩,鐘燕南,梁佳欣,等.紅景天苷-膠原蛋白海綿支架的構建及其對大鼠皮膚創傷的修復作用[J].廣西醫學,2020,42(13):1669-1673.

[12]Dai C,Shih S,Khachemoune A.Skin substitutes for acute and chronic wound healing:an updated review[J].J Dermatolog Treat,2020,31(6):639-648.

[13]Theocharidis G,Baltzis D,Roustit M,et al.Integrated skin transcriptomics and serum multiplex assays reveal novel mechanisms of wound healing in diabetic foot ulcers[J].Diabetes,2020,69(10):2157-2169.

[14]葉超,王慶甫,陳婧,等.柚皮苷聯合骨髓間充質干細胞結合脫細胞真皮基質對軟骨損傷的修復作用及機制[J].現代中西醫結合雜志,2021,30(4):375-379,402.

[15]陳金逸,陳宗存,饒朗毓,等.hPlGF-2基因修飾的骨髓間充質干細胞對皮膚創傷修復及血管形成的作用研究[J].中國美容醫學,2020,29(10):106-111.

[16]恩和吉日嘎拉,張熠杰,李建軍,等.生物三維打印類細胞外基質硬度對骨髓間充質干細胞向皮膚附屬器細胞分化的影響[J].中華燒傷雜志,2020,36(11):1013-1023.

[17]蘇娟娟,朱永翠,張文玲.連翹苷對牙周炎大鼠p38 MAPK/c-Fos信號通路及破骨細胞活化的影響[J].口腔醫學研究,2021,37(1):33-38.

[18]方明霞,董藝超,成子安,等.P38 MAPK通路抑制劑對UC-MSC功能的影響[J].中國計劃生育學雜志,2021,29(5):866-869,1077-1079.

[19]蘭天,劉巍夢,鄒陽,等.miR-145-5p靶向TPM3通過ERK信號通路抑制甲狀腺癌TPC-1細胞侵襲和轉移[J].中國醫藥生物技術,2021,16(1):18-26.

[20]Abbasi S,Sinha S,Labit E,et al.Distinct regulatory programs control the latent regenerative potential of dermal fibroblasts during wound healing[J].Cell Stem Cell,2020,27(3):396-412.e6.

[21]Beyene R T,Derryberry SL Jr,Barbul A.The effect of comorbidities on wound healing[J].Surg Clin North Am,2020,100(4):695-705.