脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦癱大鼠的作用機(jī)理研究

何正義，鄒征偉，羅耀玲，李林材，屈家陽，賴仲宏，葉俊松

（1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化分中心；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心；3.贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.贛南醫(yī)學(xué)院江西省醫(yī)用組織工程材料與生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.贛州市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；6.贛南醫(yī)學(xué)院，贛州 341000)

腦癱會(huì)出現(xiàn)肌張力增高、反射亢進(jìn)等體征，同時(shí)肢體出現(xiàn)不同程度的癱瘓，腦癱不僅會(huì)給患者一生造成極大的精神和肉體上的痛苦，更給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每10萬人中有7人發(fā)病，每年有0.5%新生兒發(fā)生腦癱。中國現(xiàn)有600多萬腦癱患者，其中12歲以下的腦癱兒童有178萬人，我國6歲以下腦癱患兒數(shù)量已超過30萬[3-4]。目前臨床上尚無理想的腦癱治療方法，也無有效藥物，只能依靠綜合治療方法進(jìn)行早期康復(fù)干預(yù)。但療程長、見效慢，效果都不理想，即使在功能改善方面也很有限，急需研究新的有效治療方案[5-8]。

干細(xì)胞移植后可到達(dá)病損部位并分化成神經(jīng)細(xì)胞，能安全和有效地促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)[9]。文獻(xiàn)報(bào)道脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，同時(shí)能夠分泌多種生長因子和抗凋亡因子，具有抗炎、抗氧化的功能[10-11]。人體通過抽脂手術(shù)就能夠得到大量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)，獲取途徑方便，倫理影響較小[10]。目前美國多家公司正在利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行腦癱治療并進(jìn)行臨床一期及二期試驗(yàn)[10-11]。但脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在腦癱治療作用機(jī)理的研究仍然較少，其對(duì)腦組織損傷修復(fù)機(jī)理尚不明確。

Notch信號(hào)通路是一種在進(jìn)化中高度保守的信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)其在生物體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能維持中起著至關(guān)重要的作用[12-16]。目前普遍認(rèn)為激活Notch信號(hào)通路會(huì)有利于血管形成的能力和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而抑制Notch信號(hào)通路則可促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)分化過程[13-14]。但Notch信號(hào)通路在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦癱損傷修復(fù)中的具體調(diào)控機(jī)理尚不清楚。因此，急需研究在腦神經(jīng)受損后Notch信號(hào)通路所發(fā)揮作用的機(jī)理，以進(jìn)一步提高干細(xì)胞治療腦損傷疾病的作用。

腦癱中以痙攣型腦癱發(fā)病率最高，約占全部腦癱病人的70%，病變部位主要是錐體束系統(tǒng)[17]。乙醇能夠?qū)е律窠?jīng)細(xì)胞變性、萎縮、凋亡，研究表明通過大鼠腦錐體束注射無水乙醇能夠成功構(gòu)建大鼠痙攣型腦癱模型[18]，因此本課題擬采用腦錐體束注射無水乙醇法構(gòu)建腦癱大鼠[19]，研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠腦錐體束損傷的修復(fù)作用及運(yùn)動(dòng)功能改善的機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重(270±20)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中有關(guān)規(guī)定對(duì)動(dòng)物進(jìn)行操作和處理。本課題獲得贛南醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F-12(1∶1)及B-27（購于美國Gibco公司）；DAPT、蘇木素、伊紅、水合氯醛（購自北京索萊寶生物科技有限公司）；主要儀器包括二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher科技公司），全自動(dòng)腦立體定位儀51700型，EG11508型組織包機(jī)，RM2255型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，日本OLYM PUS倒置生物顯微鏡，CFX ConnectTM熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），CD45抗體（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），CD44抗體（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司），CD34抗體 （美國Novus Biologicals公司），CD90抗體（上海百塞生物技術(shù)股份有限公司），CD146抗體（德國Miltenyi Biotec公司）。

1.2 方法

1.2.1 錐體束注射無水乙醇構(gòu)建腦癱大鼠模型 取50只SD大鼠按照參照文獻(xiàn)[19]，術(shù)前禁食12 h。將大鼠按照每100 g體重1 mL的4%水合氯醛腹腔麻醉。查找腦定位圖譜，用腦定位注射儀定位大鼠腦核團(tuán)，左側(cè)錐體束的立體位置(LPY AP:-12 mm L:0.5 mm H:9.8 mm)，在錐體束部位注射15μL無水乙醇。10只正常對(duì)照組大鼠注射生理鹽水（15 μL），留針10 min后緩慢拔針做為假手術(shù)正常對(duì)照組大鼠。腦癱大鼠造模第6天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，篩選腦癱模型成功制備的大鼠，腦癱模型組和干細(xì)胞治療腦癱大鼠組各10只，假手術(shù)正常對(duì)照組大鼠10只。

1.2.2 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定取60日齡的SD大鼠，使用4%水合氯醛（1 mL/100 g體重）麻醉，70%乙醇消毒皮膚后無菌取出脂肪組織，用含1%青鏈霉素雙抗的D-Hank’s液沖洗3次。將脂肪組織剪碎為液體狀態(tài)，加入10 mL胰酶37℃消化90 min。消化完成后，加入10 mL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織，以1100 r/min離心4 min，去上清液，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后換液，用PBS洗去未貼壁的細(xì)胞，更換DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。干細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定：用PBS重懸第5代干細(xì)胞稀釋成1×106/mL的細(xì)胞懸液，1%的BSA避光封閉30 min，加入CD44、CD90、CD146、CD34、CD45抗體，室溫孵育20 min后PBS沖洗兩遍用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.3 干細(xì)胞尾靜脈注射治療腦癱大鼠 采用胰酶消化法收集第5代大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，用PBS制成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，腦癱大鼠造模成功第7天治療組通過尾靜脈注射1 mL干細(xì)胞，對(duì)照組和模型組注射1 mL生理鹽水，每周注射一次，連續(xù)注射4次。

1.2.4 行為學(xué)檢測 造模后第6天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)篩選腦癱模型成功制備的大鼠，最后一次注射干細(xì)胞后第6天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，分析干細(xì)胞對(duì)腦癱大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能的影響。

1.2.4.1 不自主運(yùn)動(dòng) 運(yùn)動(dòng)正常評(píng)價(jià)為10分，出現(xiàn)一項(xiàng)異常表現(xiàn)扣2分。異常表現(xiàn)指出現(xiàn)震顫、舞動(dòng)、抽搐、徐動(dòng)及痙攣扭動(dòng)[19]。

1.2.4.2 懸吊試驗(yàn) 讓實(shí)驗(yàn)鼠前肢扒住水平放置的玻璃棒，記錄其掉落時(shí)間。掉落時(shí)間小于10 s評(píng)分1分，10～30 s，30 s～2 min，2～5 min，大于5 min依次為2、3、4、5分[19]。

1.2.4.3 斜坡試驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)鼠頭部向下置于45度傾斜度的塑料板上。當(dāng)實(shí)驗(yàn)鼠轉(zhuǎn)動(dòng)身軀與地面夾角超過135度且轉(zhuǎn)為頭部向上，記錄時(shí)間[19]。

1.2.4.4 肌張力測定 滿分為10分：出現(xiàn)肌張力增強(qiáng)扣除4分；減低減去4分；游走性增強(qiáng)減去2分[19]。

1.2.4.5曠場實(shí)驗(yàn)測定 用長寬高分別為36 cm的無蓋塑料方盒制作成運(yùn)動(dòng)場地，盒底平均劃分成9個(gè)大小相等正方形格子，塑料方盒四周全部涂成黑色。大鼠身體部位大于50%進(jìn)入相鄰方格計(jì)為1分，大鼠后肢站立記為1分，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30 min后記錄總分[19]。

1.2.5 各組大鼠大腦組織病理學(xué)分析 最后一次行為學(xué)評(píng)價(jià)第二天用4%水合氯醛麻醉大鼠，每組各取將5只大鼠固定到手術(shù)臺(tái)上，剪開右心耳，從左心室插入輸液針頭輸入生理鹽水250 mL沖凈血液，再輸入250 mL多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，取出乙醇注射錐體束部位的腦組織放入4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后切成5μm厚的切片，做HE染色后中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍照。觀察每個(gè)大鼠腦組織同一個(gè)位置的切片，并進(jìn)行圖像分析，測出每張切片中，不重復(fù)視野內(nèi)正常神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、纖維束的數(shù)目和凋亡細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 檢測Notch信號(hào)通路相關(guān)基因 最后一次行為學(xué)評(píng)價(jià)第二天每組各取5只大鼠取錐體束注射部位腦組織提取總RNA，通過RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用熒光定量PCR試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測Notch信號(hào)通路相關(guān)基因timp1、collagen1、hes1、hey1、jag1、notch1的表達(dá)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。qPCR反應(yīng)引物如下。見表1。

表1 表格引物序列

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的的分離純化 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形、三角形。換液后48 h細(xì)胞呈梭形或扁平型。培養(yǎng)4 d左右，融合度達(dá)到80%~90%，細(xì)胞呈漩渦狀和放射狀排列，見圖1。

圖1 第5代大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

2.2 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的的分離純化 應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)（99.6%CD44+、99.8%CD90+、98.4%CD146+、99.5%CD34-、98.9%CD45-），見圖2。

圖2 流式鑒定ADSC表型

2.3 行為學(xué)評(píng)價(jià) 腦癱大鼠干細(xì)胞治療后與模型組比大鼠姿勢異常（見圖3A）、肌張力得分差異顯著(P<0.05)（見圖3B），步行姿態(tài)差異極顯著(P<0.01)（見圖3C），玻璃棒懸吊時(shí)間明顯增長，差異極顯著(P<0.01)（見圖3D），提示大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能改善明顯。曠場試驗(yàn)結(jié)果差異顯著(P<0.05)（見圖3E），提示大鼠探索能力增加，腦神經(jīng)改善明顯。

圖3 腦癱大鼠干細(xì)胞治療后行為學(xué)評(píng)價(jià)

2.4 大鼠腦錐體束注射乙醇損傷組織HE染色觀察結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠腦錐體束注射乙醇損傷組織做病理切片，HE染色后腦細(xì)胞排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞聚積或者局部軟化灶（見圖4A）；腦癱模型組大鼠發(fā)現(xiàn)腦神經(jīng)細(xì)胞密度明顯減少，可見小膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元核固縮、變小變形、壞死崩解，膠質(zhì)細(xì)胞吞噬，腦組織排列紊亂，較多凋亡細(xì)胞，可見許多膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生性膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)，形成大量纖維化結(jié)節(jié)病變現(xiàn)象，推測模型組腦神經(jīng)組織未能再生因此就以纖維化形式修復(fù)（見圖4B）；干細(xì)胞治療組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞再生非常明顯，治療組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量約是模型組的2倍，個(gè)別細(xì)胞固縮、壞死，軸突樹突較多，有少量小膠質(zhì)細(xì)胞無膠原纖維化結(jié)節(jié)等病變現(xiàn)象（見圖4C），這些結(jié)果證實(shí)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效減輕腦組織損傷，減輕腦神經(jīng)纖維化修復(fù)，能夠促進(jìn)腦神經(jīng)再生修復(fù)。

圖4 ADSCs治療后大鼠錐體束損傷位置腦組織HE染色病理圖（200×）

2.5 Notch信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)檢測 與模型組比，治療組大鼠timp1表達(dá)量顯著降低（P<0.01），提示干細(xì)胞能夠有效減輕腦損傷（見圖5A），collagen1基因表達(dá)顯著降低（P<0.001），提示干細(xì)胞能夠顯著降低腦神經(jīng)組織纖維化修復(fù)（見圖5B）。hes1基因表達(dá)顯著降低（P<0.001）（見圖5C），jag1表達(dá)量顯著降低（P<0.05）（見圖5F），hey1基因表達(dá)明顯升高（P<0.001）（見圖5D），這些結(jié)果提示干細(xì)胞通過調(diào)控Notch相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)腦癱大鼠腦神經(jīng)損傷修復(fù)，有效減輕腦損傷及纖維化修復(fù)。

圖5 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療后Notch信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量

3 討論

近年來產(chǎn)生了許多治療腦癱的方法，包括藥物治療和物理療法。然而，目前的治療方法并不理想，幾乎沒有有效的治療方法[20]。因此，迫切需要新的腦癱治療策略。

近年來，國內(nèi)外在臨床上采用干細(xì)胞治療腦癱取得了一定成效，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療數(shù)據(jù)已證實(shí)干細(xì)胞在臨床腦癱治療中有巨大的應(yīng)用前景[21-24]。Guo[25]等采用慢病毒介導(dǎo)micro RNA-26a(miR-26a)修飾的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)改善了腦癱大鼠腦組織損傷，抑制了腦組織細(xì)胞凋亡。Garza-Bedolla[26]等證實(shí)因缺氧缺血性腦病導(dǎo)致嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的患者采用干細(xì)胞治療后臨床治療效果明顯改善。Boruczkowski[27]采用間充質(zhì)干細(xì)胞治療小兒腦癱，54例患者中48例(88.9%)的健康狀況有所改善，48例(88.9%)患者生活質(zhì)量提高，21例(38.9%)患者自理水平提高。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞獲取來源方便，倫理影響小，獲取成本低[28-29]。然而，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控中樞神經(jīng)再生和治療腦癱的具體機(jī)制尚未明確，有待深入研究其治療機(jī)理，為下一步利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞高效治療腦癱奠定基礎(chǔ)。

目前，腦癱動(dòng)物模型的造模方法包括頸總動(dòng)脈結(jié)扎缺氧法、錐體束注射無水乙醇法、宮內(nèi)感染法、神經(jīng)毒素法及宮內(nèi)缺氧缺血法等。但各種腦癱動(dòng)物模型在模擬腦癱的發(fā)病機(jī)制、病理改變和臨床表現(xiàn)上都不盡完美[30]。痙攣型腦癱占腦性癱瘓患兒的70%左右，因此本課題采用大鼠錐體束注射乙醇構(gòu)建痙攣型腦癱大鼠具有重要意義[19]。精確定位注射無水乙醇等試劑的腦癱造模具有多種優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以選擇成年SD大鼠，成活率高、操作簡單，動(dòng)物腦癱行為明顯且穩(wěn)定，一致性比較好，能夠模擬錐體束損傷所致腦癱[19]。通過行為學(xué)評(píng)價(jià)及組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了腦癱大鼠模型。

本實(shí)驗(yàn)通過尾靜脈注射腦癱大鼠發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效改善無水乙醇注射錐體束導(dǎo)致的大鼠腦癱。與模型組比，治療組大鼠玻璃棒懸吊時(shí)間明顯增長，步行姿態(tài)、姿勢異常、肌張力得分明顯較高，提示大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能改善明顯。

組織的損傷修復(fù)包括完全再生和不完全再生修復(fù)。完全再生是由損傷周圍的同種細(xì)胞來修復(fù)，再生細(xì)胞完全恢復(fù)原有組織、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。不完全再生修復(fù)由纖維組織加以修復(fù)以后形成癍痕經(jīng)纖維組織發(fā)生的再生，又稱瘢痕修復(fù)，無法恢復(fù)原有組織的功能，這種修復(fù)是無效修復(fù)。一般情況下神經(jīng)組織再生能力弱，通常會(huì)形成為纖維結(jié)締組織團(tuán)。腦損傷部分病理組織分析發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療組大鼠腦組織細(xì)胞排列明顯比模型組整齊，Timp1與組織損傷程度正相關(guān)，通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)治療組大鼠Timp1表達(dá)量顯著降低。模型組大鼠腦損傷組織纖維化修復(fù)明顯偏多是無效修復(fù)，Collagen1與組織纖維化修復(fù)相關(guān)，而通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)模型組Collagen1明顯偏多，這與病理組織分析結(jié)果一致。這些結(jié)果表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效治療大鼠腦癱運(yùn)動(dòng)功能，促進(jìn)損傷腦組織完全再生修復(fù)，有望恢復(fù)神經(jīng)功能。

Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱）DNA結(jié)合蛋白、Notch的調(diào)節(jié)分子等組成[31]。Notch信號(hào)的產(chǎn)生是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體如Jagged1與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過三次剪切，由胞內(nèi)段（NICD）釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix,BHLH）轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用[32]。大量研究證實(shí)Notch信號(hào)通路參與腦神經(jīng)的再生修復(fù)[32]。劉宗秀[13]等報(bào)道應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路，可減輕局灶性腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，增加了小鼠大腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的活力，同時(shí)增強(qiáng)了神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。Yang[31]證實(shí)激活Notch信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡。Long[32]證實(shí)調(diào)控Notch信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。本研究qRT-PCR研究結(jié)果顯示，大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞顯著抑制了Notch信號(hào)通路中Notch蛋白配體JAG1（P<0.05）的基因表達(dá)，HES1基因表達(dá)顯著降低（P<0.001），而HEY1基因表達(dá)明顯升高（P<0.001）。本研究的結(jié)果與前人研究基本一致[32]，推測脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療后促使Notch信號(hào)通路的Notch蛋白配體Jag1、Hes1降低，Hey1升高，從而在促進(jìn)腦組織損傷的再生修復(fù)中發(fā)揮重要作用。但Notch1基因表達(dá)水平在治療組與模型組差異不顯著，這可能存在著其他信號(hào)通路影響，具體機(jī)制有待深入研究。

本研究提示，通過調(diào)控Notch信號(hào)通路可能為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦癱提供一種新的有前景的治療策略。