煙草根黑腐病抗性位點RBRR1的InDel分子標記開發與分析

馮智宇，陳學軍，蓋曉彤，姜寧，焦芳嬋，吳興富，童治軍，劉天彥，楊林明，許美玲，李永平*

生物技術

煙草根黑腐病抗性位點的InDel分子標記開發與分析

馮智宇1，陳學軍1，蓋曉彤1，姜寧1，焦芳嬋1，吳興富1，童治軍1，劉天彥2，楊林明2，許美玲1，李永平1*

1云南省煙草農業科學研究院，云南省昆明市五華區圓通街33號，650021；2云南省煙草公司曲靖市公司，云南省曲靖市麒麟區玄天路51號，655099

【背景和目的】是通過遠緣雜交與回交導入栽培煙草的一個單顯性廣譜型根黑腐病抗病位點，為了開發基于該位點的簡單高效穩定且成本低的緊密連鎖分子標記。【方法】在已有酶切擴增多態性序列（Cleaved amplified polymorphism sequences, CAPS）標記相關序列基礎上，利用云曬1號基因組與抗、感根黑腐病材料重測序信息，基于其序列插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）多態性設計抗病相關分子標記，并開展遺傳效應和遺傳變異分析。【結果】篩選到4對具有良好多態性的引物，在目標單株的分子標記輔助選擇中具備便捷、高效且呈共顯性的特點。遺傳效應分析表明，通過分子標記輔助選擇導入位點能夠極顯著提高栽培煙草根黑腐病抗性。遺傳變異分析結果顯示，在煙草核心種質資源中僅有白肋煙TN90和SoTa2攜帶有抗病基因，并發現4對引物在普通煙草自然群體中呈現2種基因型。【結論】抗病位點在我國尚未進行廣泛利用，具有較高的利用價值；而開發的4個InDel標記可用于該抗性位點的分子標記輔助選擇育種和后續抗病基因的精細定位與克隆。

煙草；根黑腐；根串珠霉菌；分子標記輔助選擇；InDel標記

煙草根黑腐病（Black root rot, BRR）是由土壤真菌根串珠霉菌（）引起的一種常見土傳病害[1]。該病害在世界主要煙葉產區廣泛分 布[2-3]，在我國云南、貴州等煙葉主產區均有發生[4-5]。煙草根黑腐病的特征是煙草根和幼莖基部等部位出現黑色病變，進而導致煙草營養缺乏、發育遲緩，嚴重時出現倒伏、死亡，或導致成株期植株矮化、長勢不均勻、葉片皺縮或萎蔫、成熟期推遲，從而嚴重影響煙草產量和質量[1,6]。盡管輪作及施用化學藥劑能有效防控根黑腐病，但增加了煙草種植成本且易造成環境污染[7]，故選育并種植抗根黑腐病品種是一種經濟有效且可持續的防治策略。

迪勃納氏煙草（i，2n = 4x = 48）是源于澳大利亞的一種野生煙草，它不僅是研究雜交特性的理想材料，而且攜帶煙草根黑腐病、霜霉病和白粉病等多種病害抗性基因，已成為煙草抗病性狀改良的有效遺傳資源[8-9]。通過種間雜交和回交，迪勃納氏煙草根黑腐病的顯性抗病基因已成功被轉育到白肋煙與烤煙等栽培煙草中[10-11]。例如，Tennessee 90（TN90）是美國田納西州立大學用Burley49和PVY202雜交選育而成的優良品種，對煙草普通花葉病毒病（, TMV）、煙草脈斑駁病毒病（, TVMV）、煙草蝕紋病毒病（, TEV）、馬鈴薯Y病毒（Y, PVY）、煙草野火病（）、煙草根黑腐病等多種病害表現明顯抗性；其中，TN90的根黑腐抗性（基因）從品種Burley49繼承而來，而Burley49的原始抗性供體是迪勃納氏煙草[11-12]。前人研究發現對煙草根黑腐病具有完全抗性，并在煙草各生育階段均對根串珠霉菌具有較高的免疫能力[11,13]。通過基因分型測序（genotyping-by-sequencing, GBS）方法，煙草抗性位點已被定位在煙草17號染色體（K326參考基因組）上，SS219555和SS192650是與其共分離的共顯性酶切擴增多態性序列（Cleaved amplified polymorphism sequences, CAPS）標記[14]。然而，CAPS標記必須使用限制性內切酶，需要較冗長的分析步驟，增加了CAPS標記的使用成本和實驗難度，并受限于酶切效率不能適應高通量自動化檢測[15]；此外，各種突變會引起酶切位點的增加或消失，極大限制了兩個分子標記在分子標記輔助選擇育種（Molecular marker assisted selection, MAS）中的應用。因此，開發一種方便檢測且能適應高通量要求的根黑腐病抗性分子標記，是開展煙草根黑腐病品種選育的迫切需求。

本文基于與連鎖的CAPS標記的引物序列，以云曬1號（G306）基因組為參考，錨定了抗病位點的物理區間；又通過對攜帶抗病基因材料TN90和感病材料云煙87的重測序數據的遺傳差異分析，開發并篩選獲得了方便檢測的插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）分子標記。隨后，利用這些分子標記進行了標記輔助抗病選育，鑒定了抗病位點導入的遺傳效應，并分析了位點在煙草核心種質資源中的分布，為下一步開展烤煙抗根黑腐病品種選育及基因的克隆奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為攜帶有抗性位點的普通煙草TN90與烤煙主栽品種云煙87。前期研究中，以TN90為供體親本、以云煙87為受體親本，通過連續回交獲得了74個BC3F1單株產生的74份BC3F2種子，作為74個BC3F1:2家系。從這些家系中發現14個家系含有抗病位點，選取一個含有抗病位點的TN90/云煙87衍生的BC3F2群體用于新開發/轉化標記的驗證，并結合分子標記輔助選育方法篩選BC3F2群體中純合抗性位點基因型和純合感病基因型單株用于抗性表型鑒定。以337份不同煙草類型種質資源為研究材料分析抗性位點的等位基因頻率分布。兩份親本材料和337份種質資源來源于云南省煙草農業科學研究院種質庫。

病原菌根串珠霉菌（）由西南大學植物保護學院竇彥霞老師提供[1,16]。

1.2 引物設計及優化

前人已測序獲得了根黑腐病抗病和感病材料中SS219555和SS192650標記所在位點的擴增序列[14]，據此研究結果，利用軟件DNAMan（Version 9.0.1.116）分別對每個標記所在位點抗、感材料中的等位序列進行序列對比分析，根據序列的插入缺失（InDel）差異設計開發標記，將兩個共分離CAPS標記轉化成免酶切的InDel類型標記。

前期研究中已獲取了云曬1號（G306）的基因組序列和普通煙草TN90和云煙87的重測序序列（尚未發表）。本文以云曬1號為參考序列，通過BLAST方法錨定SS219555和SS192650標記之間的物理區段，并分析TN90和云煙87重測序數據以獲取兩者之間的序列差異信息。隨后，根據兩個CAPS標記所在物理區間內的InDel差異位點設計開發標記。

參照吳迷等[17]所述方法進行InDel分子標記開發并稍作改良。具體步驟如下：篩選出插入/缺失大于等于5 bp的InDel位點，提取InDel位點上下游125 bp序列并生成fasta文件，使用BatchPrimer3（v1.0, https:// wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/）批量設計引物，引物長度范圍為18～27 bp，最適長度21 bp，GC含量范圍在40%～60%之間，擴增片段150～200 bp，最優擴增片段180 bp。對返回的設計結果進行檢查和手動調整。為了提高特異性，本文對BRR_LG2_InD-5標記進行PCR擴增測序和引物設計優化。

為了豐富抗病位點的檢測方式以滿足不同育種科技工作者的需求，基于本研究所獲InDel標記只有2種基因型的特點，結合云煙87和TN90的重測序數據，靶向InDel標記在雙親中擴增序列的序列差異之處，設計TN90序列特異的引物，將部分InDel共顯性標記轉化為顯性標記，并對其做了試驗驗證，共篩選出3個顯性標記。

1.3 DNA提取、PCR擴增和電泳檢測

選用植物基因組提取試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取供試材料基因組DNA，具體操作步驟按說明書進行。PCR反應體系：2×DreamTaq Green PCR Master Mix（dNTP濃度為0.4 mmol/L, Mg2+（濃度為4 mmol/L）5 μL），正、反引物（2 μmoL/L）各1 μL，DNA模板2 μL（濃度50～100 ng/μL），補充ddH2O到10 μL。PCR程序設置：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，設置35個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠或1%的瓊脂糖電泳檢測。

1.4 煙草根黑腐抗性鑒定

按照Chen等描述的根部擴散法（Root irradiation）進行煙草根黑腐病抗性鑒定[18]。在人工氣候室采用滅菌土培養煙草供試材料，設定（30±1）℃/（28±1）℃的日/夜溫度、85%～90%的相對濕度以及14 h的光照時間，直至第4片真葉出現。同時，將單孢分離得到的根串珠霉菌（）病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar, PDA）平板上，在25℃暗箱培養10～15 d，收獲分生孢子后，用無菌水配成孢子濃度為107孢子/mL的懸浮液。利用無菌剪刀對四葉期煙苗的莖基兩側根系進行輕微傷害，立即灌根接種20 mL的孢子懸浮液于煙株莖基部，并隨后將供試煙苗放置于人工氣候室進行培養。在接種后第15 d，第一片枯萎葉片出現時，用清水洗凈煙株根系，參照國家標準GB/T 23222—2008進行病害等級鑒定，計算病情指數（disease severity index, DSI）。所有對照處理用滅菌水進行。試驗設計采取隨機區組設計，共設置3個生物學重復，每個重復每個基因型包含15個單株。每個重復獨立計算病情指數。

2 結果與分析

2.1 RBRR1抗性位點共顯性分子標記的轉化、開發及優化

抗病和感病材料SS219555和SS192650標記所在DNA擴增區段序列對比發現，在SS192650標記位點817 bp的序列區間內共檢測到50個單核苷酸多態性（Single-nucleotide polymorphism, SNP）和5個InDel差異位點，其中有2個InDel位點序列差異大于5 bp；在SS219555標記位點629 bp的序列區間內共檢測到9個SNP和4個InDel差異位點，其中有2個InDel位點序列差異大于5 bp（圖1）。根據SS192650位點和SS219555位點的InDel差異信息分別設計1對和3對引物（圖1；表1）。利用含有抗病基因的材料TN90和不含該抗病位點的材料云煙87對引物進行差異分析，其中InD192650和InD219555-3F/3R具有良好的多態性（圖2）。

注：（a）SS192650位點的序列對比；（b）SS219555位點的序列對比。紅色框和箭頭顯示轉化InDel分子標記所在位置。TKF2002和TKF7002分別是前人報道的抗性和感病材料。

表1 轉化與開發的RBRR1抗性位點共顯性標記

注：泳道1和2為云煙87；泳道5和6為TN90；泳道3和4為F1。

以云曬1號基因組序列為參考，通過BLAST方法將SS219555和SS192650標記錨定到其Chr2染色體上，并將兩者之間的物理區段（191,732,059～193,313,373）作為目標區間。利用TN90和云煙87重測序數據以及云曬1號參考基因組序列對目標區間開發InDel分子標記，在目標區間內共獲得6個InDel標記，分別命名為BBR-LG2-InDel-1～6（表1）。對這些標記進行篩選，共有2個標記具有較好的多態性，分別是BRR_LG2_InD-2和-5（圖2）。

在后續的標記使用過程中，BRR_LG2_InD-5在分離群體中表現出3種以上帶型，不利于準確讀取基因型。因此，我們進一步對BRR_LG2_InD-5標記進行優化，在多態性位點兩側分別增設1條正引物和4條反引物（表1）。通過BRR_LG2_InD-5標記多條正反引物的組合及篩選，檢測結果顯示BRR_LG2_InD-5- 2F/2R，-2F/4R和-2F/5R均具有良好的多態性，其中BRR_LG2_InD-5-2F/4R的條帶比較清晰（圖3）。然而，在TN90/云煙87的分離群體中進行檢測時，雖然3個標記能夠檢測出抗性位點，但是3個標記均表現為顯性標記特征，即所有單株基因型均具有云煙87的帶型（圖3）。綜上所述，將InD192650，BRR_LG2_ InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R作為抗性位點共顯性分子標記用于后續分析。

注：泳道A、F1和B分別為云煙87、雜交1代基因型和TN90；泳道1-15為BC3F2單株。箭頭指示云煙87擴增條帶所在位置。

2.2 分子標記輔助選擇

本研究前期已獲得以TN90為供體親本、云煙87為輪回親本的74個BC3F1:2家系。選取每個家系27個單株混合取樣用于基因型檢測，并利用上述轉化或開發的標記進行分子標記輔助選擇，共發現14個含有抗病位點的株系，這些株系可用作后續的抗病育種。

2.3 抗性位點的遺傳效應分析

為了分析抗病位點導入云煙87后的遺傳效應，選取云煙87和TN90衍生的一個含有抗病位點的BC3F2群體進行研究。選用上述4個分子標記進行基因型分析，在285個BC3F2單株中，目標區間基因型為純合抗病位點基因型（記作）、純合感病基因型的材料（記作）及雜合基因型的個體數目分別為60、76和149個，且沒有檢測到遺傳交換單株。選取和基因型單株在溫室條件下進行根黑腐抗病性鑒定。同時，在同樣條件下考察TN90和云煙87的根黑腐病抗性。結果表明，云煙87平均病情指數為59.26%，TN90所有測試單株均未發病，其病情指數為0。對應的和在根黑腐病的抗性上表現出極顯著差異；材料的根黑腐抗病平均病情指數為20.39%，材料的根黑腐抗病平均病情指數為72.35%（圖4）。

注：（a）RBRR1位點在染色體上的位置（以云曬1號為參考基因組）；（b）RBRR1位點的遺傳定位，數據參考文獻[14]；（c）RBRR1位點定位區間各分子標記的物理位置；（d）BC3F2世代RBRR1位點的兩種重組類型；（e）BC3F2世代RBRR1+和RBRR1-基因型單株接菌后根系表型（左）和根黑腐病抗性統計（右）。比例尺=2 cm；**P < 0.01，t測驗。為了方便繪圖，將BRR_LG2_InD-1、-2、-3、-4、-5和-6分別簡寫為InD-1、-2、-3、-4、-5和-6。

2.4 根黑腐抗性位點的遺傳變異分析

為了進一步探究抗病位點在自然群體中的分布，利用4個InDel標記對包含不同調制類型的普通煙草（SSTT）材料進行基因型分析，以檢測抗病位點的等位變異頻率。結果表明，在337份普通煙草核心種質資源中，共檢測到2份煙草材料（Sota2和TN90）含有抗病位點，基因型頻率為0.59 %（表2）。表性鑒定結果顯示，Sota2與TN90具有相似的根黑腐病抗性表型（表4，圖5）。由此推測，該抗病位點尚未在我國煙草生產中普及應用。由于上述4個InDel共顯性標記在自然群體中均表現為只有2種基因型，因此，將其中3個InDel標記轉化為檢測抗病位點的特異顯性標記，分別為DM192650- 2F/2R、DM219555-2F/2R和DM5-1F/2R，為KASP轉化及高通量應用奠定基礎（表3，圖5）。

表2 不同材料中RBRR1抗病位點的等位變異頻率

注：SoTa2、Burley21和Kentucky14為白肋煙，Hicks broad leaf、Virginia Gold和Yellow Special為國外烤煙。

表3 RBRR1抗性位點顯性分子標記

表4 部分材料根黑腐病抗性鑒定

注：表中數據為不同等級或死亡單株統計數，“.”代表沒有對應等級單株。加粗的兩個材料TN90和SoTa2攜帶抗性基因。

3 討論

3.1 RBRR1位點InDel分子標記可用于標記輔助選擇育種

分子標記輔助選擇回交育種已經在農作物抗病育種、品質育種中得到廣泛應用[19-22]。在分子標記輔助選擇過程中，分子標記的可靠性、分子標記的多態性水平、檢測所需DNA的質和量、檢測流程和檢測成本被認為是限制分子標記廣泛應用的5個因素[23]。CAPS標記的特點使其適合于相對較小的實驗室開展定位克隆基因組目標區段/目標基因或多態性分析研究[15]，而在分子標記輔助選擇中受限。本研究在前人研究基礎上，錨定了抗性位點的2個共分離CAPS標記SS219555和SS192650的基因組所在物理區間，并根據這2個標記的兩翼序列以及TN90和云煙87的重測序數據，基于抗、感材料序列的InDel多態性轉化、開發獲得多個共顯性、免酶切的分子標記。進而，利用InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R進行分子標記輔助選擇，篩選出根黑腐抗性顯著提高的BC3F2世代位點純合單株，這些材料可用于后續的抗根黑腐品種選育。以上結果表明，本研究轉化或開發的4個InDel標記可用于根黑腐抗性育種的分子標記輔助選擇和后續的抗病基因定位。

小片段易位系是目前將野生資源優異基因導入生產作物最為理想的方式。一般來說，具有較小的外來片段的易位系在遺傳上更穩定，產生有害影響的可能性更小。例如，在主糧作物小麥的研究中發現，冰草6P染色體小片段的插入易位系Pubing3035的粒重和穗長顯著提高，并根據連鎖圖譜將易位斷點定位在小麥1A染色體短臂的著絲粒附近[24]。與此類似，前人同樣通過遺傳連鎖圖譜將基因定位在17號染色體（K326基因組）的SS127301和SS166247標記之間[14]；同時，本研究將基因共分離標記SS219555和SS192650錨定到Chr2染色體（G306基因組，Chr2長=201,712,017 bp）長臂末端，表明基因是以片段易位而非整臂易位的形式被導入到普通煙草中。前人測序發現攜帶基因的抗性材料中SS219555和SS192650標記兩翼序列與i一致[14]，說明2個標記之間的序列為外源片段。通常情況下，位于一個親緣關系較遠的外源易位插入片段的標記表現為顯性標記，即只能在外源片段上擴增出條帶；然而，在本研究的標記開發鑒定過程中，所轉化和開發的標記均為共顯性標記。其次，如果插入親緣關系較近的外源片段，則標記在擴增攜帶有外源插入片段的親本材料時（在本研究中為TN90抗性親本）應表現為兩條擴增條帶，分別是煙草自身和外源片段擴增條帶。然而，本研究轉化和開發的標記擴增TN90時均為單一條帶。同時，在對BRR_LG2_InD-5標記的改良過程中，BRR_LG2_InD-5-2F/2R，-2F/4R和-2F/5R在分離群體的所有單株中均能夠擴增出云煙87的帶型。綜上，推測基因是以一個外源片段替換易位而非插入易位的形式導入到普通煙草，對攜帶基因抗性材料基因組組成的鑒定尚需要進一步研究。

3.2 RBRR1位點在我國煙草育種中的利用價值

由于早期栽培所用普通煙草品種對根黑腐病沒有抗病能力，煙草根黑腐病給全世界煙草種植者造成了巨大的損失。隨后，抗病位點在白肋煙上的應用使得根黑腐病情得到了有效控制[5]。本研究發現，在我國國內烤煙、國內曬煙和香料煙、國外引進烤煙資源以及國外引進曬煙中均未攜帶抗病位點，僅在引進的白肋煙中發現2個材料攜帶有該抗病位點，表明抗病位點在我國尚未進行廣泛利用，具有較大的利用價值。

緊密連鎖標記將有助于識別重組事件，從而打破潛在的不利連鎖。有報道發現來自迪勃納氏煙草的易位小片段不僅攜帶有抗病位點，可能還和一些不良農藝性狀及化學特質相關[25]，限制了在烤煙中的廣泛應用。本研究獲得的4個共顯性InDel標記將有助于抗病位點后續的精細定位，從而打破連鎖累贅。同時，遺傳變異分析結果表明，InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R分子標記在擴增自然群體時僅表現為2種基因型，而并非如SSR標記在擴增普通煙草的不同材料時表現出多種基因型。因此，將其中3個標記轉化為檢測抗病位點的顯性標記，為后續的KASP標記轉化及高通量基因型鑒定奠定了基礎。

4 結論

本研究在前人的研究基礎上，以云曬1號基因組為參考，錨定了煙草根黑腐抗病位點的物理區間。利用云曬1號參考基因組與抗、感根黑腐病材料重測序數據，篩選并獲得了4個多態性良好、免酶切的煙草根黑腐病抗病基因的緊密連鎖分子標記，克服了現有CAPS標記的缺點。通過標記輔助篩選應用和遺傳效應分析，鑒定獲得了煙草根黑腐病抗性極顯著提高的云煙87改良株系。通過自然群體遺傳變異分析，發現4對引物在普通煙草自然群體中呈現2種基因型，并發現僅有白肋煙SoTa2與TN90攜帶有抗病位點。綜上所述，抗病位點在我國尚未進行廣泛利用，具有較高的利用價值，而本研究獲取的4個分子標記能夠簡單、高效、穩定地用于該抗病基因的輔助選育。

[1] 竇彥霞，徐林，馬冠華，等. 煙草根黑腐病菌ISSR標記的遺傳多樣性分析[J]. 煙草科技，2017, 50(11): 9-15.

DOU Yanxia, XU Lin, MA Guanhua, et al. Genetic diversity analysis ofby ISSR method[J]. Tobacco Science & Technology, 2017, 50(11): 9-15.

[2] Lucas G.B., Diseases of tobacco, 3rd edn[M]. Raleigh, N. Carol. USA: Biological Consulting Associates. 1975, 621 pp.

[3] Trojak-Goluch A and Berbe A. Resistance to black root rot (Nag. Raj and Kendrick) and some growth characteristics in doubled haploid derivatives of the F1hybrid of tobacco (L.)[J]. Polish Journal of Agronomy, 2009.

[4] 陳瑞泰，朱賢朝，王智發，等. 全國16個主產煙省（區）煙草侵染性病害調研報告[J]. 中國煙草科學，1997(04): 3-9.

CHEN Ruitai, ZHU Xianchao, WANG Zhifa, et al. A report of investigating and studying tobacco infectious diseases of 16 main tobacco producing provinces (regions) in China[J]. Chinese Tobacco Science, 1997(04): 3-9.

[5] 朱賢朝，王彥亭，王智發. 中國煙草病害[M]. 北京：中國農業出版社，2002.

ZHU Xianchao, WANG Yanting, WANG Zhifa. Tobacco diseases of China[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2002.

[6] 查道喜. 煙草病蟲害的發生及防治[J]. 現代農業科技，2018(20): 117.

ZHA Daoxi. Occurrence and control of diseases and insect pests in tobacco. Modern Agricultural Science and Technology, 2018(20): 117.

[7] Haji H M, Brammall R A, and VanHooren D L. Effect of theblack root rot resistance gene on the yield and quality characteristics of flue-cured tobacco in Ontario[J]. Canadian Journal of Plant Science, 2003, 83(4): 939-942.

[8] Duan W, Wang L, and Song G-Q.- mediated transformation of wild tobacco species,, and[J]. American Journal of Plant Sciences, 2016, 7.

[9] Zeng Jianmin, Huang Changjun, Liu Yong, et al. The complete chloroplast genome sequence of(Solanaceae)[J]. Mitochondrial DNA. Part B, Resources, 2021, 6(3): 1042-1043.

[10] Trojak-Goluch Anna, Laskowska Dorota, Agacka Monika, et al. Effectiveness of combining resistance toandin haploid tobacco genotypes[J]. Breeding science, 2011, 61(4): 389-393.

[11] Hoffbeck L J. Burley 49, a new disease-resistant burley tobacco[M]. Knoxville: University of Tennessee, Agricultural Experiment Station. 1965, 18.

[12] Miller R D. Registration of ‘TN 90’ burley Tobacco[J]. Crop Science, 1991, 31(3): 852.

[13] Clayton E E. The study of resistance to the black root rot disease of tobacco[J]. Tobacco Science, 1969, 13(12): 30-37.

[14] Qin Qiulin, Li Yuting, Ding Na, et al. Development of user-friendly markers for disease resistance to black root rot of tobacco through genotyping by sequencing[J]. Molecular Breeding, 2018, 38(6): 1-7.

[15] Shavrukov Y N. CAPS markers in plant biology[J]. Russian Journal of Genetics: Applied Research, 2016, 6(3): 279-287.

[16] 竇彥霞，彭雄，余佳敏，等. 中國煙草根黑腐病菌根串珠霉菌群及rDNA-ITS序列分析[J]. 菌物學報，2012, 31(04): 531-539.

DOU Yanxia, PENG Xiong, YU Jiamin, et al. Grouping and rDNA-ITS sequence analysis ofon tobacco in China[J]. Mycosystema, 2012, 31(04): 531-539.

[17] 吳迷，汪念，沈超，等. 基于重測序的陸地棉InDel標記開發與評價[J]. 作物學報，2019, 45(02): 196-203.

WU Mi, WANG Nian, SHEN Chao, et al. Development and evaluation of InDel markers in cotton based on whole-genome re-sequencing data[J].Acta Agronomica Sinica, 2019, 45(02): 196-203.

[18] Chen Juanni, Wu Lintong, Lu Mei, et al. Comparative study on the fungicidal activity of metallic MgO nanoparticles and macroscale MgO against soilborne fungal phytopathogens[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11(365).

[19] Singh Ashok K, Singh Vikas K, Singh Atul, et al. Introgression of multiple disease resistance into a maintainer of Basmati rice CMS line by marker assisted backcross breeding[J]. Euphytica, 2015, 203(1): 97-107.

[20] Vida Gyula, Gál Mariann, Uhrin Andrea, et al. Molecular markers for the identification of resistance genes and marker-assisted selection in breeding wheat for leaf rust resistance[J]. Euphytica, 2009, 170(1): 67-76.

[21] Zhou P, Tan Y, He Y, et al. Simultaneous improvement for four quality traits of Zhenshan 97, an elite parent of hybrid rice, by molecular marker-assisted selection[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 106(2): 326-331.

[22] Zhao Xianrong, Tan Guoqing, Xing Yuexian, et al. Marker-assisted introgression ofto improve maize resistance to head smut[J]. Molecular Breeding, 2012, 30(2): 1077-1088.

[23] Bertrand C Y Collard and David J Mackill. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2008, 363(1491): 557-572.

[24] Zhang Jing, Zhang Jinpeng, Liu Weihua, et al. Introgression of6P chromosome segment into common wheat for enhanced thousand-grain weight and spike length[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2015, 128(9): 1827-1837.

[25] Legg P D, Litton C C and Collins G B. Effects of theblack root rot resistance factor on agronomic and chemical traits in burley tobacco[J]. Theoretical and applied genetics, 1981, 60(6): 365-368.

Development and haplotype analysis of insertion–deletion (InDel) molecular markers for resistance locusto black root rot of tobacco ()

FENG Zhiyu1, CHEN Xuejun1, GAI Xiaotong1, JIANG Ning1, JIAO Fangchan1, WU Xingfu1, TONG Zhijun1, LIU Tianyan2, YANG Linming2, XU Meiling1, LI Yongping1*

1 Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650021, Yunnan, China;2 Qujing Tobacco Company of Yunnan Province, Qujing 655099, Yunnan, China

is a single dominant broad-spectrum locus coffering resistance to black root rot that was introduced into tobacco () by remote hybridization and backcross, and the development of efficient, stable, low-cost and user-friendly tightly linked molecular markers is an effective approach for resistance breeding by marker-assisted selection and for location of functional gene within the locus.In this study, we anchored the region oflocus based on the primer sequences of published CAPS markers, and acquired four polymorphism markers targeting insertion-deletion (InDel) within the region ofusing the genome sequence of Yunshai#1 as reference and the resequencing data of a pair of resistant and susceptible root black rot materials. These markers were convenient, efficient and codominant in molecular marker-assisted selection of target individuals.Genetic effect analysis showed that the introduction ofthrough marker-assisted selection could significantly improve the resistance to black root rot in cultivated tobacco. Haplotype analysis showed that only TN90 and SoTa2 carriedin the tobacco core germplasm resources, and four pairs of primers presented two genotypes in the natural population of common tobacco.Collectively, our data indicated that the four InDel markers have high utilization value in marker-assisted selection and subsequent mapping of the functional gene.

tobacco, black root rot,, molecular marker-assisted selection, InDel marker

Corresponding author. Email：1303046997@qq.com

中國煙草總公司云南省煙草公司科技項目“優質抗病烤煙新品種選育”（2019530000241001）；河北省自然科學基金項目“甜瓜根系分泌物中化感物質與鐮孢枯萎菌的互作關系研究”（C2019402430）

馮智宇（1990—），博士，助理研究員，主要從事煙草功能基因組與育種研究，Tel：0877-2075074, Email：ffengzhiyu@163.com

李永平（1966—），Tel：0871-65113766，Email：1303046997@qq.com

2021-11-04；

2022-02-22

馮智宇，陳學軍，蓋曉彤，等. 煙草根黑腐病抗性位點RBRR1的InDel分子標記開發與分析[J]. 中國煙草學報，2022，28（4）.FENG Zhiyu, CHEN Xuejun, GAI Xiaotong, et al. Development and haplotype analysis of insertion–deletion (InDel) molecular markers for resistance locus RBRR1 to black root rot of tobacco (Nicotiana tabacum)[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi:10.16472/ j.chinatobacco. 2021.T0203