石菖蒲提取物調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化減輕AD小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)、緩解認(rèn)知功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究

吳昌安 曹岐新

阿爾茨海默病（alzheime’s disease，AD）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)以認(rèn)知能力下降和行為功能障礙為主要特征，是十分常見的癡呆類型［1］。AD的防治已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［2］。目前研究表明［3-5］，石菖蒲具有抗心腦血管硬化與栓塞、抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用；在神經(jīng)退行性疾病的防治中也有重要作用。大數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測，石菖蒲活性物質(zhì)中存在79個化合物可能與AD有著密切關(guān)系［6］。已有研究證實(shí)石菖蒲揮發(fā)油及其水提液可阻止Aβ25-35由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，以抑制β淀粉樣蛋白的沉聚，減輕其神經(jīng)毒性；石菖蒲中β-細(xì)辛醚可下調(diào)AD大鼠中GAP-43、PSD-95表達(dá)水平，上調(diào)SYP的表達(dá)，從而增加大鼠海馬中CA1區(qū)突觸數(shù)目，進(jìn)而改善大鼠認(rèn)知功能［7］。本研究探討石菖蒲調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化減輕AD小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)并改善認(rèn)知功能障礙的作用及機(jī)制，為開發(fā)針對AD的新型藥物提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 WT小鼠：SPF級C57BL/6J小鼠（雄性），6~8個月齡，體重30~35 g，AD轉(zhuǎn)基因小鼠：SPF級APP/PS1小鼠（雄性），6~8個月齡，體重30~35 g。購于上海南方模式生物科技股份有限公司（合格證號：312024300000732）。

1.2 主要試劑 石菖蒲飲片（三九藥業(yè)），ELISA試劑盒（Abnova，KA1158），高爾基試劑盒（hitobiotec，HTKNS1125），BACE1抗 體（proteintech，12807-1-AP），Aβ抗體（proteintech，25524-1-AP）；ADAM10抗體（proteintech，25900-1-AP）；PS1抗體（proteintech，16163-1-AP）；GAPDH抗 體（proteintech，60004-1-Ig）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）石菖蒲提取物純化：取100 g石菖蒲飲片粉碎后置于圓底燒瓶并加入1,000 mL超純水，加熱沸騰后轉(zhuǎn)溫火繼續(xù)熬制1 h，取第1遍水提液；再加入400 mL超純水繼續(xù)第2次熬制，后將2次所收集的水提液混合后離心2次（3,000 r/min，5 min），取上清液，蒸發(fā)濃縮至100 mL，使得藥物濃度為1 g/mL。（2）動物模型與分組：實(shí)驗(yàn)分為4組，0.9%氯化鈉溶液灌胃的野生型小鼠（WT+NS組），石菖蒲提取物灌胃的野生型小鼠（WT+AT組），0.9%氯化鈉溶液灌胃的AD轉(zhuǎn)基因小鼠（AD+NS組），石菖蒲提取物灌胃的AD轉(zhuǎn)基因小鼠（AD+AT組）。每次灌胃石菖蒲提取物10 g/kg，對照組灌胃相同體積的0.9%氯化鈉溶液。（3）水迷宮：① 訓(xùn)練期：小鼠頭朝池壁放入水迷宮中。記錄動物游泳路徑及尋找平臺所用時間，并讓小鼠停留在平臺10 s，連續(xù)5 d，每天每只小鼠訓(xùn)練4次。②測試期：第6天，將平臺拆除，將小鼠從原先平臺的對側(cè)象限放入水中。記錄60 s，觀察小鼠進(jìn)入原平臺象限所花時間和穿越該象限的次數(shù)。（4）免疫印跡：小鼠脫頸處死后取海馬，放入離心管中加入蛋白裂解液，在冰上給予組織破碎后靜置30 min，4℃下12,000 r/min離心25 min，最后取上清液作為初樣品。采用BCA法測定濃度后制樣。經(jīng)過PAGE凝膠電泳（80 V）分離蛋白，接著將蛋白通過電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂牛奶在室溫下封閉至少2 h。孵上按說明書以特定比例稀釋一抗，4℃環(huán)境下孵育過夜。次日給予PBS清洗后在室溫下二抗孵育2 h并清洗。于暗房內(nèi)滴加ECL液顯色。所有結(jié)果以GADPH為內(nèi)參校正后再進(jìn)行比較。（5）高爾基染色：按Kit說明書進(jìn)行，溶液1和2須提前1 d混合備用，次日只取上清液。小鼠麻醉處死后取腦，PBS洗去血跡與腦膜后，轉(zhuǎn)入混合液后避光下室溫處理2周。接著將腦組織轉(zhuǎn)移致溶液3，再次避光處理2~7 d。裹上OCT，在干冰凍結(jié)后直接在冷凍切片機(jī)上切片，厚度100μm，轉(zhuǎn)移至玻片上避光24 h。溶液4和5，各5 mL，再添加15 mL水，混均后，把片子放進(jìn)混合液15 min，依次在50%、75%、95%、100%酒精溶液中梯度脫水，最后二甲苯透明，中性樹脂封片。在共聚焦顯微鏡下觀察。（6）ELISA：先將ELISA板以特定抗體所包被，然后以封閉液進(jìn)行封閉，按重復(fù)孔位依次加入稀釋后樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，搖床上孵育1 h，加入顯色液顯色，立即在酶標(biāo)儀上檢測450 nm處樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)蛋白濃度。（7）qRT-PCR：應(yīng)用Trizol法提取小鼠海馬總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物稀釋至10μmol/L，按照以下比例進(jìn)行配置：2×SYBR Green Master 5μL + Forward primer（10μmol/L）0.3μL + Reverse primer（10μmol/L）0.3μL + cDNA Template 10 ng，給予Nuclease-free 水加至總體積為10 μL，并給予混合。將板置于qRTPCR儀上測量，最后數(shù)據(jù)用2-ΔΔCт方法進(jìn)行分析。（8）小膠質(zhì)細(xì)胞分離及流式細(xì)胞分選：小鼠灌注后取下海馬組織置于流式細(xì)胞術(shù)緩沖液，剝離腦膜后轉(zhuǎn)移至15 mL Tenbroeck homogenizer中，震蕩以破碎組織。以70μm細(xì)胞過濾柱過濾2次，收集單細(xì)胞懸液。離心后以流式細(xì)胞儀緩沖液重懸后轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀管中。把細(xì)胞標(biāo)記上帶有抗CD11b、CD45等小膠質(zhì)標(biāo)記物，4℃避光孵育30 min。以含1%PFA PBS溶液重懸細(xì)胞。在流式細(xì)胞儀檢測：選擇活細(xì)胞后依據(jù)脈沖寬度和面積比選擇線性分布細(xì)胞，消除碎屑。依據(jù)不同標(biāo)記獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析、多因素重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠水迷宮尋找平臺的時間 與WT+NS組比較，AD+NS組中小鼠尋找平臺的時間延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。AD+AT組小鼠從訓(xùn)練第2天開始，尋找平臺的時間逐漸縮短，直至訓(xùn)練后第5天，與AD+NS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但時間仍長于WT+NS組，見表1。

表1 各組小鼠在水迷宮中尋找平臺的時間（s）

2.2 石菖蒲提取物處理后，AD小鼠海馬中突觸的數(shù)目有所恢復(fù) 與WT+NS組比較，AD+NS組小鼠突觸數(shù)目下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AD+AT組小鼠突觸數(shù)目比AD+NS組有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但突觸數(shù)目仍少于WT+NS組，見表2。

表2 石菖蒲提取物處理后各組小鼠的突觸數(shù)目比較（±s）

表2 石菖蒲提取物處理后各組小鼠的突觸數(shù)目比較（±s）

注：與WT+NS組比較，*P＜0.05；與AD+NS組比較，#P＜0.05

組別 n 突觸數(shù)目WT+NS 3 11.75±1.71 WT+AT 3 11.25±1.71 AD+NS 3 4.75±0.96*AD+AT 3 8.75±1.71*#F值 16.931 P值 ＜0.001

2.3 各組小鼠海馬中Aβ、BACE1、PS1、ADAM10表達(dá)水平比較 與WT+NS組比較，AD+NS組海馬中總Aβ的表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.05）。AD+AT組小鼠Aβ的表達(dá)水平比AD+NS組小鼠下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但仍高于WT+NS小鼠，見表3。各組小鼠BACE1、PS1、ADAM10表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表3 各組小鼠的Soluble/insoluble Aβ表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組小鼠的Soluble/insoluble Aβ表達(dá)水平比較（±s）

注：與WT+NS組比較，*P＜0.05；與AD+NS組比較，# P＜0.05

組別 n Soluble insoluble WT+NS 3 1.00±0.33 1.00±0.19 WT+AT 3 0.96±0.17 0.99±0.22 AD+NS 3 2.40±0.26* 3.47±0.21*AD+AT 3 1.73±0.15*# 2.00±0.36*#F值 24.389 63.624 P值 ＜0.001 ＜0.001

表4 各組小鼠BACE1、PS1和ADAM10蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組小鼠BACE1、PS1和ADAM10蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別 n BACE1 PS1 ADAM10 WT+NS 3 1.00±0.33 1.00±0.20 1.00±0.20 WT+AT 3 0.99±0.22 1.02±0.27 1.03±0.21 AD+NS 3 1.07±0.15 1.09±0.21 1.00±0.26 AD+AT 3 1.06±0.29 0.97±0.25 1.13±0.46 F值 0.075 0.156 0.126 P值 0.972 0.923 0.942

2.4 各組小鼠海馬中IL-8、IL-10、IL-1β與TNF-α的表達(dá)水平比較 與WT+NS組比較，AD+NS組小鼠海馬中IL-1β、TNF-α表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AD+AT組與AD+NS組比較，IL-1β、TNF-α表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但仍高于WT+NS組。與WT+NS組比較，AD+NS組小鼠海馬中IL-8、IL-10表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AD+AT組比AD+NS組小鼠IL-8、IL-10表達(dá)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 各組小鼠海馬中IL-8，IL-10，IL-1β與TNF-α的表達(dá)水平的比較（±s）

表5 各組小鼠海馬中IL-8，IL-10，IL-1β與TNF-α的表達(dá)水平的比較（±s）

注：與WT+NS組比較，*P＜0.05；與AD+NS組比較，#P＜0.05

組別 n IL-1β TNF-α IL-8 IL-10 WT+NS 3 1.00±0.33 1.00±0.20 1.00±0.36 1.00±0.21 WT+AT 3 1.02±0.23 1.05±0.27 0.97±0.25 1.01±0.08 AD+NS 3 12,830.33±1,980.32* 12,943.33±1,501.54* 4,333.33±4,163.33* 4,333.33±3,511.88*AD+AT 3 728.67±473.26*# 966.67±404.15*# 93,000.00±28,053.52*# 81,666.67±23,629.08*#F值 114.98 198.64 31.33 31.92 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 各組小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞向M2極化的比例比較 與AD+AT組比較，AD+NS組小鼠海馬中的M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞比例上調(diào)，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AD+NS組比較，AD+AT組小鼠海馬中M2表型小膠質(zhì)細(xì)胞比例上調(diào)，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

目前AD發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制仍不明確，眾多研究假說中Aβ錯誤折疊并在神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成淀粉樣斑塊獲得多數(shù)學(xué)者認(rèn)可［8-9］。Aβ是由β淀粉樣前體蛋白（APP）在三種不同的水解酶——α-分泌酶（ADAM10）、β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶（PS1）水解后產(chǎn)生，在大腦皮層與海馬中聚集、沉積并最終形成具有神經(jīng)毒性的Aβ淀粉樣斑塊，導(dǎo)致神經(jīng)的退行性改變［2］。

研究證實(shí)炎癥反應(yīng)是AD的重要病理生理基礎(chǔ)，神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞［10］，其功能異常與AD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-12］。目前研究認(rèn)為，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后可向不同的亞型極化，分別是加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)的M1型細(xì)胞，分泌促炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1β等加重神經(jīng)損傷，還有抗神經(jīng)炎癥反應(yīng)的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，分泌IL-8、IL-10等抗炎性因子等保護(hù)神經(jīng)并促進(jìn)損傷后修復(fù)等［13-14］。研究發(fā)現(xiàn)AD病理生理過程中小膠質(zhì)細(xì)胞可異常增殖并活化后向Aβ淀粉樣斑塊聚集，在這一過程中小膠質(zhì)細(xì)胞向M1和（或）M2極化：M1型釋放促炎因子誘導(dǎo)神經(jīng)炎性損傷，而M2型吞噬Aβ斑塊，分泌抗炎因子促進(jìn)組織修復(fù)［15］。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1與M2極化可能是延緩AD進(jìn)程的潛在靶點(diǎn)。

石菖蒲有諸多藥用價值，如抗心腦血管硬化與栓塞、抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等［7］。有研究認(rèn)為石菖蒲中的β-細(xì)辛醚、丁香酚可促進(jìn)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶，降低AD小鼠腦中的Aβ淀粉樣斑塊，上調(diào)LRP-1及LRP-2水平。也有研究認(rèn)為，石菖蒲揮發(fā)油可下調(diào)AD大鼠中GAP-43、PSD-95的表達(dá)水平和線粒體膜電位，促進(jìn)SYP表達(dá)，增加海馬神經(jīng)突觸數(shù)量，進(jìn)而改善AD大鼠認(rèn)知功能障礙［16］。本研究顯示，石菖蒲提取物處理后AD小鼠水迷宮尋找平臺時間減少，證實(shí)石菖蒲提取物可改善AD小鼠的認(rèn)知記憶能力。為了進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲提取物處理后AD小鼠海馬中突觸的數(shù)目有所恢復(fù)，這可能是石菖蒲提取物改善AD小鼠認(rèn)知、記憶能力的組織學(xué)基礎(chǔ)。由于Aβ淀粉樣斑塊的沉積是AD的病理基礎(chǔ)之一，采用ELISA檢測小鼠海馬中Aβ的表達(dá)水平，證實(shí)石菖蒲提取物可下調(diào)AD小鼠海馬中Aβ水平；同時，針對APP的三種水解酶進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)BACE1、PS1、ADAM10表達(dá)水平并未發(fā)生改變，這證實(shí)Aβ水平的改變與水解酶無關(guān)，需要對Aβ的清除過程進(jìn)一步探索。由于Aβ所致神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD病程中至關(guān)重要。因此，以qRT-PCR檢測小鼠海馬中炎癥因子的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石菖蒲提取物處理后AD小鼠海馬中IL-1β、TNF-α表達(dá)下調(diào)，而IL-8、IL-10表達(dá)上調(diào)，這表明石菖蒲提取物可抑制AD所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。IL-1β、TNF-α與IL-8、IL-10分別是M1與M2兩種小膠質(zhì)細(xì)胞亞型所分泌的代表性炎癥因子，以流式細(xì)胞學(xué)檢測小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞極化水平發(fā)現(xiàn)，石菖蒲提取物處理后AD小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞向M2極化的比例提高，這也與石菖蒲提取物處理后炎癥因子的改變相吻合。

綜上所述，石菖蒲提取物可通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M2極化從而減輕AD小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)并改善AD小鼠的認(rèn)知記憶功能障礙，為石菖蒲提取物臨床應(yīng)用于治療AD提供一種實(shí)驗(yàn)依據(jù)。