維生素D對(duì)小鼠結(jié)核感染后獲得性免疫的影響

翁芳芳 余建平 徐凱進(jìn)

結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病。我國(guó)是結(jié)核病大國(guó)，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一［1］。文獻(xiàn)報(bào)道維生素D的缺乏與結(jié)核病的發(fā)生可能有所關(guān)聯(lián)［2］，維生素D補(bǔ)充劑可在高危人群中幫助人們抵抗結(jié)核病，其機(jī)制可能與先天免疫和獲得性細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)［3］。本研究探討維生素D對(duì)小鼠結(jié)核感染獲得性免疫細(xì)胞的影響，并通過檢測(cè)T細(xì)胞因子水平探究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 （1）BALB/c小鼠：5~6周齡SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠，共60只，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)。所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。（2）H37Ra標(biāo)準(zhǔn)菌株：該菌株購(gòu)于上海康朗生物科技有限公司。菌株在羅氏培養(yǎng)基固定培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為37℃，恒溫保濕。培養(yǎng)20 d后，無菌刮取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛呈菜花樣的菌落進(jìn)行研磨，用0.9%氯化納溶液配制成20 mL菌懸液，其濃度為5×106CFU/mL［4］。（3）藥品與試劑：Vitamin D3（740551，1 mL），Mouse IFN-γ ELISA Kit（RAB0225），Mouse IL-4 ELISA Kit（RAB0300），Mouse IL-17 ELISA Kit（RAB0263）購(gòu)于sigma公司，Mouse TGF-β 1 ELISA KIT（SEKM-0035）購(gòu)于Solarbio公司，PE Anti-CD3（ab22268，50 test），APC Anti-CD8（ab237368，100ul），F(xiàn)ITC Anti-CD4（ab59474，50 test）購(gòu)于Abcam公司。（4）儀器設(shè)備：BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)），MD pectraMax190酶標(biāo)儀（美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）小鼠分組及飼養(yǎng)條件：60只5~6周齡雄性小鼠于SPF級(jí)鼠房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為18~28℃，日溫差≤3℃，相對(duì)濕度40%~70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、感染組和維生素D干預(yù)組，每組各20只。（2）結(jié)核感染及干預(yù)方式：感染組和維生素D干預(yù)組的小鼠通過尾靜脈注射H37Ra菌株，注射劑量為1.0×106CFU/0.2 mL，對(duì)照組注射等量0.9%氯化納溶液［4］。維生素D干預(yù)組當(dāng)天肌肉注射維生素D，7 μg/kg，1次/3 d，連續(xù)8周，對(duì)照組和感染組注射等量0.9%氯化納溶液。按照小鼠建模及實(shí)驗(yàn)原則，進(jìn)行H37Ra結(jié)核菌株培養(yǎng)的明場(chǎng)圖，以確定菌株培養(yǎng)的準(zhǔn)確性；各組小鼠接種結(jié)核菌株后，解剖小鼠的肺組織病理宏觀圖及微觀圖，以確定造模的成功。（3）流式細(xì)胞檢測(cè)：小鼠眼眶取血后，進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，1,500 r/min離心5 min，PBS重懸外周血單核細(xì)胞（peripheral Mononuclear Blood Cell，PBMC），將配好的CD3、CD4、CD8混合抗體加入1.0×106細(xì)胞中，4℃避光孵育30 min，2 mL PBS清洗后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞型及細(xì)胞比例［5］。（4）ELISA檢測(cè)血漿細(xì)胞因子：使用小鼠IFN-γ、IL-14 、IL-17及TGF-β ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)血清樣本中 IFN-γ、IL-14 、IL-17及TGF-β含量水平，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以（n）表示，采用檢驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維生素D干預(yù)對(duì)小鼠感染后主要臟器質(zhì)量的影響 感染組與維生素D干預(yù)組小鼠脾臟、肺、腎臟、肝臟質(zhì)量均與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且感染組與維生素D干預(yù)組各器官質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠主要臟器質(zhì)量的影響［g，（±s）］

表1 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠主要臟器質(zhì)量的影響［g，（±s）］

對(duì)照組 感染組 維生素D干預(yù)組體重 22.21±2.11 22.19±3.2 21.97±1.97脾臟 0.0061±0.0001 0.0060±0.0011 0.0060±0.0009腎臟 0.011±0.001 0.012±0.007 0.012±0.001肺0.0053±0.0005 0.0058±0.0015 0.0054±0.0007肝臟 0.042±0.0035 0.041±0.0025 0.041±0.0027

2.2 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠外周血T細(xì)胞亞群影響 與對(duì)照組比較，感染組和維生素D干預(yù)組CD3+T細(xì)胞比例增加（P＜0.01），CD4+T細(xì)胞比例增加（P＜0.001），CD8+T細(xì)胞降低（P＜0.01），CD4+/CD8+T細(xì)胞比例升高（P＜0.01），維生素D干預(yù)組CD4+/CD8+T細(xì)胞比例與感染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠T細(xì)胞亞群的影響（±s）

表2 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠T細(xì)胞亞群的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01，**P＜0.001；與感染組比較，#P＜0.05

指標(biāo) 對(duì)照組 感染組 維生素D干預(yù)組CD3+ T 54.3±1.69 64.27±1.69* 65.31±2.17*CD4+ T 40.33±1.24 55.9±2.82** 56.3±1.72**CD8+ T 14.2±2.82 11.1±1.41* 10.9±3.21*CD4+ /CD8+ T 3.11±0.18 5.04±0.31* 5.13±0.26*#

2.3 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠外周血Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞因子的影響 與對(duì)照組比較，維生素D干預(yù)組和感染組小鼠均出現(xiàn)IFN-γ、IL-17及TGF-β增加，IL-4降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。維生素D干預(yù)組小鼠各細(xì)胞因子表達(dá)水平比感染組小鼠高，且IFN-γ表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠外周血T細(xì)胞因子的影響（±s）

表3 維生素D對(duì)結(jié)核感染小鼠外周血T細(xì)胞因子的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01，**P＜0.001；與感染組比較，#P＜0.01

指標(biāo) 對(duì)照組 感染組 維生素D干預(yù)組IFN-γ 28.26±11.45 61.57±20.19** 75.31± 2.17**#IL-4 19.34±8.67 14.15±12.01** 13.9±1.72**Il-17 17.16±7.24 21.49±10.34** 20.91±3.21**TGF-β 12.04±4.91 18.48±6.65* 19.13±0.26*

3 討論

自2007年以來，結(jié)核病一直位居單一傳染病死因之首，甚至高于人們熟知的艾滋病，是全球前十位死因之一［1］。韓俊鋒等［6］證實(shí)肺結(jié)核患者血清中維生素D水平低于正常人群，維生素D缺乏與肺結(jié)核的嚴(yán)重程度相關(guān)，同時(shí)增加肺結(jié)核的傳染性及患病風(fēng)險(xiǎn)，使活動(dòng)性肺結(jié)核治療的療程延長(zhǎng)和痰轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長(zhǎng)。

近年來，維生素D在先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的研究逐漸被重視［7］，維生素D與其受體結(jié)合后，會(huì)促使獲得性免疫細(xì)胞釋放IFN-γ，IFN-γ進(jìn)一步激活先天免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞來吞噬結(jié)核菌，且巨噬細(xì)胞會(huì)釋放一種陽(yáng)離子細(xì)胞殺傷肽（LL-37），進(jìn)一步抵抗結(jié)核菌的毒性作用［8］。維生素D的缺乏也被證實(shí)與肺部的多種疾病相關(guān)，包括肺結(jié)核疾病、急性肺損傷、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等［9］。但GANMAA等［10］提出補(bǔ)充維生素D并未顯著預(yù)防結(jié)核病感染風(fēng)險(xiǎn)，因此維生素D的作用存在爭(zhēng)議。

維生素D在體內(nèi)多種酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?，25-二羥維生素D3，而通過巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞呈遞的1，25-二羥維生素D3可介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)維生素D產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥性Th1和Th17細(xì)胞的抑制，同時(shí)誘導(dǎo)免疫耐T調(diào)節(jié)（Treg）反應(yīng)［7］。本研究結(jié)果表明，維生素D干預(yù)組均出現(xiàn)CD3+T，CD4+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值增加，CD8+T細(xì)胞降低，提示維生素D可以進(jìn)一步免疫調(diào)節(jié)。

Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，通過巨噬細(xì)胞殺滅組織內(nèi)的病毒、細(xì)菌等，Th2細(xì)胞與超敏變態(tài)反應(yīng)，如過敏性皮炎、過敏性哮喘等密切相關(guān)［11］。本研究顯示，維生素D干預(yù)組和感染組小鼠出現(xiàn)IFN-γ、IL-17及TGF-β升高，IL-4降低，同時(shí)維生素D干預(yù)組小鼠IFN-γ表達(dá)水高于感染組，提示免疫應(yīng)答以Th1細(xì)胞為主。一項(xiàng)研究［12］指出在利用卡介苗導(dǎo)致小鼠結(jié)核感染的模型中，維生素D添加組與缺乏組相比，維生素D缺乏會(huì)影響結(jié)核感染小鼠的免疫能力，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞下降，CD4+/CD8+比值上升，IFN-γ下降，IL-10上升。表明與免疫損傷密切相關(guān)的CD4+/CD8+比值與結(jié)核易感程度呈負(fù)相關(guān)，而IFN-γ與本研究結(jié)果相反，這可能需要更多的研究去證實(shí)。