絡石藤揮發油抗炎鎮痛藥理作用分析

沈云方 王青華 汪洋

中藥絡石藤性苦，微寒，是一味重要的抗風濕清熱藥。其具有祛風通絡、涼血消腫等功能，主治風濕熱痹、腰膝疼痛、肌肉痙攣、癰腫、喉嚨痛、跌打損傷等［1］。現代藥理學研究表明，絡石藤莖、葉中含木脂素類、黃酮類、甾醇和三萜類等成分［2］；具有抗炎、鎮痛和抗腫瘤等諸多藥理活性［3］。研究表明，絡石藤水提物和醇提物均具有一定抗炎、鎮痛作用，β-谷甾醇苷［4］和牛蒡子苷元［5］是其活性成分之一，而其含量豐富的絡石苷類則未呈現良好的抗炎、鎮痛活性［2］。植物揮發油是一類具有芳香氣味的次生代謝產物，具有消炎、止痛、祛風、祛痰、止咳、抗菌等功效［6］。本研究旨在觀察絡石藤揮發油抗炎、鎮痛活性，分析其是否為中藥絡石藤功效成分。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠（SPF級），體重（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗動物生產許可證號：SYXK（浙）2018-0012。飼養環境溫度（24±2）℃，濕度40%~60%，12 h光照周期，自由飲食飲水。

1.2 儀器及試劑 Biotek Synergy H1全功能酶標儀（美國伯騰），BD Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司），絡石藤（亳州市奇弘堂藥業有限公司），二甲苯和冰乙酸（國藥集團化學試劑有限公司），角叉菜膠（Sigma公司），地塞米松磷酸鈉（揚州制藥有限公司），水合氯醛（上海富蔗化工有限公司），CBA試劑盒（美國BD公司）。

1.3 實驗方法 （1）絡石藤揮發油提取：稱取絡石藤藥材粉末500 g，加入4 L蒸餾水，以二氯甲烷為萃取劑，采用同時蒸餾萃取法提取4 h；收集二氯甲烷有機相，無水硫酸鈉干燥過夜；過濾收集二氯甲烷相，25 ℃減壓去除二氯甲烷，得到淡黃色揮發油。（2）二甲苯所致小鼠耳廓腫脹實驗：隨機將ICR小鼠分為5組（每組8只），試劑對照組（模型組）、地塞米松組（10 mg/kg）、絡石藤揮發油低劑量組（40 mg/kg）、絡石藤揮發油中劑量組（80 mg/kg）和絡石藤揮發油高劑量組（120 mg/kg）。試劑對照組腹腔注射0.9%氯化納溶液（含0.5 %聚山梨酯-80），給藥組腹腔注射對應劑量各藥物。連續給藥7 d（1次/d），末次給藥30 min后用微量移液器于小鼠右耳兩側均勻涂抹20 μL二甲苯，左耳不處理作為對照，造模1 h后頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪取兩耳；對齊合并兩耳，8 mm直徑打孔器大取同一部位圓耳片；立即稱重，以右耳減去左耳重量差值作為腫脹度，計算腫脹抑制率（%）=（試劑對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/試劑對照組平均腫脹度×100%。（3）角叉菜膠所致小鼠組織腫脹實驗［7］：造模前于踝關節處作標記，以采用容積測定法測定右后肢足跖體積；末次給藥30 min后每只小鼠右后肢足跖部皮下注射1%角叉菜膠20 μL，分別于造模1 h、2 h和4 h測定足跖體積；以致炎前后足跖體積差值作為腫脹度，計算腫脹抑制率（%）=（試劑對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/試劑對照組平均腫脹度×100%。（4）棉球所致肉芽腫實驗［8］：小鼠腹腔注射5 %水合氯醛0.1 mL/10 g，麻醉后剃去前肢腋下及近背部位毛發，75%酒精消毒后，切開一小口，取重約10 mg的滅菌棉球，兩側前肢腋部皮下分別各植入一個棉球，隨即縫合，造模次日開始給藥。末次給藥1 h后頸椎脫臼處死小鼠，解剖觀察棉球肉芽腫及周圍血管情況，連同周圍結締組織一起取出，其中一側棉球60 ℃烘干24 h稱重，該干重減去原棉球重量即為肉芽腫干重。另一側棉球剪碎，加1 mL無菌PBS勻漿，3,000 r/min離心10 min取上清，Cytometric Bead Array（CBA）法測定細胞因子水平［9］。（5）醋酸扭體實驗：末次給藥1 h后小鼠腹腔注射0.6%乙酸 0.1 mL/10g，觀察記錄小鼠15 min內扭體次數，統計分析揮發油鎮痛作用。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件及Graph Pad Prism6.0繪圖軟件。計量資料以（±s）表示；多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.5為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絡石藤揮發油對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹抑制作用 二甲苯處理后模型組小鼠右耳重量相比未處理的左耳顯著增加，腫脹度達（4.285±1.240）mg。與模型組相比，地塞米松組、絡石藤揮發油中劑量組、高劑量組預處理均可降低腫脹度（P＜0.01）；且絡石藤揮發油中、高劑量組與地塞米松組差異無統計學意義（P＞0.05），其中絡石藤揮發油中、高劑量組腫脹抑制率分別達40.055%和62.331%。見表1。

表1 絡石藤揮發油對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹抑制作用（n=8）

2.2 絡石藤揮發油對角叉菜膠所致足趾腫脹抑制作用 角叉菜膠注射后小鼠足趾腫脹明顯，模型組腫脹度2 h左右達到峰值，4 h已有所下降；除低劑量處理組外，其它各給藥組均隨時間延長腫脹抑制率增加，絡石藤揮發油低、中、高處理組各時間檢測點對腫脹度均呈典型的劑量依賴性抑制作用，尤其中、高劑量組與模型組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 絡石藤揮發油對角叉菜膠所致足趾腫脹抑制作用（n=8）

2.3 絡石藤揮發油對肉芽腫及炎癥因子抑制作用 模型組棉球與組織粘連較難分離，表面血絲分布較為豐富，棉球干重達到（8.145±0.829）mg，表明組織增生明顯。絡石藤揮發油可劑量依賴性抑制棉球干重增加，其中低劑量組與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05），而中、高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.01），且高劑量組與地塞米松組棉球干重，差異無統計學意義（P＞0.05），表明絡石藤揮發油對肉芽組織增生有較好抑制作用。見圖1A。慢性炎癥過程中浸潤的白細胞會釋放大量炎癥因子，并進一步加入炎癥反應，因此對肉芽組織中炎癥因子含量進行測定。結果表明，模型組肉芽組織中白介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平均較高，地塞米松可降低上述炎癥因子水平（P＜0.01）；絡石藤揮發油也可劑量依賴性降低各炎癥因子水平，與模型組比較，中、高劑量組差異均有統計學意義（P＜0.01），尤其高劑量處理組與地塞米松組相當。見圖1B-D。

圖1 絡石藤揮發油對肉芽腫及炎癥因子抑制作用

2.4 絡石藤揮發油對醋酸扭體抑制作用 與模型組比較，地塞米松組，絡石藤揮發油中、高劑量組均能減少醋酸誘導的小鼠扭體反應（P＜0.01）。見表3。

表3 絡石藤揮發油對醋酸扭體抑制作用［n=8，（±s）］

表3 絡石藤揮發油對醋酸扭體抑制作用［n=8，（±s）］

注：與模型組比較，*P＜0.01；與地塞米松組比較，#P＜0.01

組別 扭體次數 鎮痛率（%）模型組 18.375±3.701#地塞米松組 2.875±1.553* 84.354低劑量組 17.250±2.493# 6.122中劑量組 8.125±2.588*# 55.782高劑量組 2.125±1.126* 88.435

3 討論

中藥絡石藤具有祛風止痛，舒筋活絡等功效，常作為復方成分之一用于治療風濕性關節炎，四肢酸痛和腰腿疼痛等病癥。如絡石藤飲［10］、風濕痹痛膠囊［11］和四藤湯［12］等。尤其劉祖貽善用藤類通絡藥治療類風濕關節炎，絡石藤即為其常用組方藤類中藥材之一［13］。相對絡石藤在臨床方劑中的廣泛應用，其單味藥藥理學研究相對薄弱。

過度炎癥反應、疼痛等是風濕性關節炎的主要病理特征之一，大多抗炎、鎮痛類藥物對其具有治療或緩解作用［14］；本研究結果顯示，絡石藤揮發油具有顯著的抗炎和鎮痛作用，尤其高劑量組（120 mg/kg）對二甲苯所致耳廓腫脹、角叉菜膠所致足趾腫脹、棉球肉芽腫抑制作用和醋酸所致疼痛鎮痛作用幾乎與地塞米松（10 mg/kg）相當。研究表明，絡石藤水提物對醋酸所致疼痛和角叉菜膠所致足趾腫脹也具有較好的抑制作用，但其灌胃劑量＞1.0 g/kg時藥效作用才與陽性對照藥吲哚美辛作用相當［15］。與絡石藤水提物相比，其揮發油抗炎、鎮痛活性藥效劑量顯著降低，當然，這可能還與給藥途徑等因素有關。

綜上，絡石藤揮發油可能是其治療風濕性關節炎的功效成分之一。因此，有必要進一步對絡石藤揮發油成分及抗炎、鎮痛可能分子機制開展深入研究。