三種實驗室診斷技術在結核病診斷中的應用價值

潘清波 余旭良 鄭小金 袁羅翔 祝進

肺結核病是一種由結核分枝桿菌引起的病死率較高的慢性疾病，全球公共衛生安全領域均面臨巨大的挑戰［1］。據世界衛生組織估計，全球每年因結核病而引起的死亡人數達300萬人，我國是全球22個結核病高感染率的國家之一［2］，結核病的發病率達99/10萬人。目前肺結核實驗室檢測方法主要是抗酸桿菌染色法和細菌培養法。近年來，WHO向全球推薦了新的檢測耐藥結核病的方法GeneXpert MTB/RIF［3］，主要應用于肺結核的快速診斷及結核菌對利福平的敏感性檢測。有報道稱，在不同地區的GeneXpert MTB/RIF系統對于肺結核病的診斷存在差異［4］。作者對臨床上診斷為肺結核患者的痰液進行抗酸染色、液體培養、GeneXpert MTB/RIF檢測，評價三種方法診斷肺結核的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1~8月本院就診并住院的結核患者或疑似結核患者584例，男478例，女106例；年齡14~92歲。臨床表現有咳嗽、咯血、低熱或CT顯示肺部有陰影等，且排除其他疾病。均留取痰標本進行抗酸染色、液體培養和GeneXpert系統檢測結核分枝桿菌。根據我國肺結核診斷標準（WS 288-2017），具有典型的結核病臨床癥狀，且至少符合以下幾項之一：（1）MTB病原學檢測陽性；（2）病理學診斷支持；（3）影像學檢查支持活動性結核；（4）＞2次TBIGRA陽性且抗結核治療有效。584例患者中最終診斷為肺結核193例。

1.2 方法 （1）儀器試劑：GeneXpert儀器及配套試劑；KS-S100 Series染片機；抗酸染色液；奧林巴斯顯微鏡、海爾二級生物安全柜，MGIT320分枝桿菌培養儀器。（2）標本采集：囑咐患者留取深部痰液（晨痰、夜間痰、隨機痰），同一個標本分別進行抗酸染色、液體培養及GeneXpert MTB/RIF檢測。（3）檢測方法：①抗酸染色：先準備干凈的玻片并做好標本序號標記，竹簽挑取痰液制成痰片干燥后，酒精燈加熱固定，再上機染色，嚴格按照KS-S100 Series染色機SOP操作，染好后取出待完全干燥后鏡檢。②液體培養法：嚴格按照SOP進行操作，將痰液標本與2% NALC-NaOH 1∶1或1∶2混勻消化處理15 min后，加入緩沖液后離心，棄去上清液，加入1 mL緩沖液充分混勻后，加0.5 mL沉淀混懸液至液體管中，放入液體培養儀器中。儀器培養報陽的標本進行涂片和MPB64膠體金確認。③GeneXpert MTB/RIF：痰液標本視黏稠程度加入消化液處理15 min，中途振蕩1~2次，充分消化后的標本加入到試劑盒中，然后進行上機檢測。由GeneXpert檢測儀器根據內置程序判定菌種和利福平耐藥性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，以臨床診斷為金標準，評價三種檢測方法的診斷效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種檢測方法陽性率比較 193例結核患者中，痰涂片檢測陽性率25.9%，痰培養檢測陽性率60.6%，GeneXpert系統檢測的陽性率67.4%，GeneXpert系統檢測的陽性率＞痰培養＞痰涂片。GeneXpert系統陽性率與痰培養比較，差異無統計學意義（χ2=1.900，P＞0.05），比抗酸染色陽性率明顯提高，差異有統計學意義（χ2=66.624，P＜0.05），見表1。

表1 結核組三種檢測方法陽性率比較（n=193）

2.2 三種方法檢驗效能比較 三種方法的敏感度分別為25.9%、60.6%、67.4%，特異度為95.1%、99.5%、98.5%，陽性預測值分別為72.5%、98.3%、95.6%，陰性預測值為27.8%、83.7%、85.9%。GeneXpert系統與痰培養敏感度比較，差異無統計學意義（χ2=1.900，P＞0.05），但二者均比痰涂片敏感度高，差異有統計學意 義（χ2=66.624、47.378，P＜0.05）。GeneXpert系 統與痰培養特異度比較，差異無統計學意義（χ2=1.137，P＞0.05），但二者均比痰涂片特異度高，差異有統計學意義（χ2=6.983、14.142，P＜0.05）。見表2。

表2 肺結核診斷中三種檢測方法的診斷效能評價

2.3 GeneXpert和液體培養檢測利福平耐藥性比較 193例結核患者菌株進行液體藥敏試驗，檢測出利福平耐藥15例，敏感178例。GeneXpert 系統檢測利福平耐藥17例，利福平敏感176例。兩種方法共同對利福平耐藥14例，共同敏感175例。以液體藥敏試驗為金標準，可以得到GeneXpert 系統檢測利福平耐藥性的敏感度為93.3%，特異度為98.3%，陽性預測值82.4%，陰性預測值為99.4%，見表3。4株利福平結果兩種檢測方法不同的菌株經基因測序后，均為利福平敏感。

表3 GeneXpert和液體培養檢測利福平耐藥性比較

3 討論

傳統的抗酸染色鏡檢法操作簡單、價格成本低，至今在肺結核的防控中仍然占有重要地位，但由于抗酸染色法的檢出率低，需要大量的抗酸桿菌才能檢測出，受送檢痰液標本的質量影響較大，因此肺結核患者痰涂片抗酸染色陽性率偏低。痰液體培養法雖然可以提高肺結核患者痰液陽性檢出率，但由于結核菌生長緩慢，所需時間較長，嚴重影響肺結核患者的早期治療和防控［5］。

GeneXpert MTB/RIF系統主要是檢測結核分枝桿菌rpoB基因192 bp區間判斷結核分枝桿菌；大部分的利福平耐藥菌株可以通過檢測rpoB基因是否突變判斷利福平的耐藥性。五個探針包含了rpoB 基因的81 bp區域；球形芽孢桿菌作為特異性探針判斷GeneXpert MTB/RIF整個實驗過程的效率［6-7］。GeneXpert MTB/RIF實驗步驟簡單，實驗室人員僅需簡單培訓就可以上崗。其自動進行PCR的提取、擴增、檢測，2 h就可以完成實驗檢測［8-9］，非常有利于結核病的及時診斷。GeneXpert MTB/RIF系統對結核實驗室的要求低，具備普通二級生物安全柜就可以，非常適合在基層醫院使用。近年來，世界衛生組織大力推薦GeneXpert MTB/RIF系統［10］，該系統檢測陽性率高、安全性高、檢測時間短等優點，可較好的滿足臨床上對檢測的要求。目前主要應用于肺內和肺外標本中結核分枝桿菌和利福平敏感性的檢測等方面。

GeneXpert MTB/RIF系統檢測肺結核患者的陽性率為67.4%，略低于鐘莉等報道的68.87%，但高于陳小娟報道的41.94%［11-12］。痰培養陽性率為60.6%，略低于GeneXpert 系統檢測的陽性率。若以痰培養為金標準，GeneXpert 系統檢測的陽性率為98.3%，特異度為95.9%，與其他報道基本一致［13］。從檢驗效能看，GeneXpert MTB/RIF系統好于涂片法。