阿爾茨海默病動物模型的研究進展

盛哲津, 李利妹

(1. 同濟大學生命科學與技術學院,上海 200092; 2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院醫(yī)學轉(zhuǎn)化平臺,上海 200120)

隨著社會不斷進步、生活水平大幅提高，全球老齡化日益嚴重，隨之與年齡有關的疾病正威脅著全世界老年人的健康。阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是最重要、最常見的年齡相關神經(jīng)退行性疾病之一，也是癡呆癥最常見的病因［1］。AD患者占年齡相關癡呆診斷病例的60%～80%［1-2］。根據(jù)發(fā)病年齡的不同，AD 可分為65 歲以前發(fā)病的早老性癡呆和65 歲以后發(fā)病的老年性癡呆［2］。1906年，阿洛伊斯·阿爾茨海默檢查了一位失憶了3 年后死亡婦女的大腦，發(fā)現(xiàn)了一些不尋常的團塊（稱淀粉樣斑塊）和纖維纏結（稱神經(jīng)原纖維，或Tau 纏結）［3］。如今，大腦中的這些斑塊和纏結被認為是AD的主要病理性特征［2，4］。此外，AD的診斷至少還需要兩種臨床癥狀，包括記憶喪失，語言、注意力、判斷和解決問題等能力受損［5］。根據(jù)AD 疾病的主要特征，目前已開發(fā)了幾種治療AD的方法。譬如，乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑，嘗試通過恢復大腦中神經(jīng)遞質(zhì)水平治療AD，但臨床結果顯示只能緩解AD患者的癥狀，并不能真正治愈AD［6-7］。理論上真正有效治愈AD 的策略應該是阻止引起神經(jīng)退行性病變的發(fā)病進程，但目前的治療都只是降低癥狀發(fā)生率。因此，需要進一步探究AD致病機制及新的更有效的治療策略。

AD 是一種由多病因引起且病理學極其復雜的疾病［8］。實驗動物模型不管是對AD 發(fā)病機制的研究還是對藥物的開發(fā)都非常重要。為了幫助闡明AD的致病機制，目前已建立了多種動物模型，包括轉(zhuǎn)基因小鼠、果蠅、魚和蠕蟲等［9］。利用上述動物模型模擬人類AD組織病理學的各個方面特征，譬如β-淀粉樣蛋白（βamyloid，Aβ）異常沉積的斑塊和Tau 蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs），這些模型大大加深了人們對AD發(fā)病機制的理解［10-11］。另外，合適的動物模型也是候選藥物進入臨床前研究時一個非常重要的工具或條件。本文就AD的主要病理組織學特征、遺傳因素、有關動物模型以及其評價指標進行綜述。

1 AD的主要病理組織學特征

AD的臨床表現(xiàn)以記憶缺陷為主，隨后其他認知功能如判斷、語言流利性或方向性逐漸減退。盡管上述AD臨床癥狀出現(xiàn)的次序可能會有所不同，但記憶損傷通常是第一個也是最主要的特征［12］。大量研究發(fā)現(xiàn)AD患者的海馬結構、大腦皮層聯(lián)合區(qū)和皮質(zhì)下結構等區(qū)域發(fā)生了一些神經(jīng)病理學改變。

1.1 Aβ斑塊

Aβ 斑塊是AD 的組織病理學特征之一［4］。淀粉樣蛋白是一類含有β-折疊的異質(zhì)性蛋白質(zhì)聚集體，對剛果紅染料具有很強的親和力。AD 患者體內(nèi)Aβ 沉積在腦膜、腦血管周圍和灰質(zhì)，是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶的蛋白水解作用產(chǎn)生，其主要的蛋白質(zhì)成分是40～42 個氨基酸組成的多肽［13］。Aβ40 是最常見的亞型；Aβ42較不常見，但更容易聚集，且神經(jīng)毒性更強［13］。根據(jù)“淀粉樣蛋白假說”，大腦中Aβ 的產(chǎn)生引發(fā)一系列病理變化，從而導致相應的AD 臨床癥狀［14］。在能夠引發(fā)Aβ產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠中，記憶障礙的嚴重程度與Aβ斑塊數(shù)量呈正相關［15］。主動或被動進行Aβ特異免疫可去除Aβ 斑塊，恢復記憶功能［16］。這些現(xiàn)象表明AD的產(chǎn)生與Aβ斑塊密切相關。

1.2 Tau蛋白的異常磷酸化與NFTs

AD的第二個病理組織學特征是神經(jīng)原纖維退行性病變，稱為NFTs，主要分布在神經(jīng)元的胞體和頂端樹突中［4］。NFTs 數(shù)量與癡呆嚴重程度之間存在正相關性［17］。細胞內(nèi)NFTs的核心蛋白為Tau蛋白，它們異常聚集形成不溶性的斑塊。Tau是一種微管相關蛋白，在穩(wěn)定微管方面起主要作用，還參與信號轉(zhuǎn)導、肌動蛋白細胞骨架形成、細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運以及磷酸酶和激酶的錨定［18］。在AD 等病理情況下，Tau 蛋白被異常過度磷酸化，導致其正常生物功能喪失；而且過度磷酸化的Tau蛋白易于與微管分離，增加了Tau蛋白的可溶性，這可能是Tau 長絲組裝的第一步［18］。在AD 患者的大腦中，Tau還發(fā)生構象改變，可溶性Tau以一種自然未折疊的構象存在［18］。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)NFTs大量存在于其他神經(jīng)退行性疾病中，如進行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy）、皮質(zhì)基底節(jié)變性（corticobasal degeneration）、嗜銀顆粒病（argyrophilic grain disease）等［19］。雖然NFTs并不是AD特有的，但是它們與神經(jīng)退行性疾病密切相關。

此外，Aβ 斑塊和NFTs 之間有協(xié)同作用。Aβ 斑塊和NFTs 經(jīng)常一起存在于異常的神經(jīng)突中［20］。因此，共同表達突變APP 和Tau 的雙轉(zhuǎn)基因動物模型，對研究兩種病變的相互作用非常有價值。

1.3 神經(jīng)炎癥

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎性反應會造成神經(jīng)元損傷，加重AD 癥狀，于是人們推測炎癥是AD 的一個可能致病因素，但直到近年來才將其作為治療靶點而得到重視［21-22］。錯誤折疊/聚集的蛋白質(zhì)與小膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞上的模式識別受體結合，激活以炎性介質(zhì)為特征的先天性免疫反應，促進AD 疾病的發(fā)展。有證據(jù)表明，膠質(zhì)細胞的激活可能通過釋放白細胞介素-1 和腫瘤壞死因子等細胞因子來驅(qū)動AD 的慢性炎癥［21］。另外，全身性炎癥和肥胖可能會干擾大腦的免疫過程，從而進一步加劇AD 疾病的進展［21］。一些研究表明，常年使用抗炎藥治療類風濕關節(jié)炎的患者對癡呆癥的發(fā)生似乎有抵抗力［22］。

1.4 與代謝異常的關系

有研究認為AD 可以稱為“3 型糖尿病”，因為某些形式的AD與胰島素抵抗有關，而胰島素抵抗是2型糖尿病的主要原因［23］。2 型糖尿病患者患老年癡呆癥或血管性癡呆癥的風險似乎也更大。上述發(fā)現(xiàn)促使研究人員開始尋找血糖紊亂與神經(jīng)退行性病變的潛在關系，而且嘗試將控制血糖的藥物用于AD的防治中［24］。

2 AD的遺傳因素

在AD的復雜病因中，除了環(huán)境因素外，遺傳因素起主要作用。根據(jù)遺傳因素，將AD分為兩種類型：家族性AD（familial AD ，F(xiàn)AD）和散發(fā)型AD（sporadic AD，SAD）［25］。

2.1 FAD

FAD 一般在65 歲之前發(fā)病，比較罕見，占所有AD病例的1%。該類型的AD通常由3個基因的一個顯性突變導致。這3 個基因分別為APP、早老素1（presenilin-1，PSEN1） 和 早 老 素2 （presenilin-2，PSEN2）［26］。

APP基因突變約占FAD的5%。1991年，在英國一個FAD 家族中發(fā)現(xiàn)APP基因的第一個錯義突變，即171 位的纈氨酸被異亮氨酸取代（V717I），后被稱為“倫敦突變”［27］。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)了更多的等位基因變異，目前共鑒定出20 多種APP基因的致病性突變。另外在瑞典的2個FAD家族中發(fā)現(xiàn)670位和671位密碼子發(fā)生雙堿基對替換，導致賴氨酸和蛋氨酸被天冬氨酸和亮氨酸取代（K670D/M671L），被稱為“瑞典突變”，簡稱APPsw［28］。

1992年，通過對14號染色體的連鎖分析發(fā)現(xiàn)了第2 個FAD 基因座，通過定位克隆鑒定發(fā)現(xiàn)PSEN1 基因［29］。進一步通過與PSEN1的同源性鑒定，又找到了位于1 號染色體的PSEN2［29］。大多數(shù)FAD 病例是由PSEN1 和PSEN2 基因突變引起。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了120 多個PSEN1 基因突變，而PSEN2 基因突變只有8個。

在FAD 中沒有發(fā)現(xiàn)Tau基因突變。但是1998 年在17 號染色體連鎖伴帕金森病的額顳癡呆（chromosome 17 in families with frontotemporal degeneration and parkinsonism，F(xiàn)TDP-17）中發(fā)現(xiàn)了Tau基因突變［30］。FTDP-17是一種與AD相關的家族性癡呆癥。這些發(fā)現(xiàn)表明Tau 的功能異常可導致神經(jīng)退行性病變，進而引起癡呆。除了額顳癡呆外，Tau突變還可引起多種疾病，如進行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、皮質(zhì)基底節(jié)變性和蒼白球腦橋黑質(zhì)變性［31］。

2.2 SAD

SAD大多在65歲以后發(fā)病，稱為遲發(fā)性AD，在老年人中較常見，但無明顯家族遺傳。FAD 與SAD 的組織病理學特征難以區(qū)分。流行病學研究表明，大約30%的SAD 患者中至少有一個一級親屬患病的家族病史，其中10%有明顯的常染色體顯性遺傳［25］。一些基因位點的多態(tài)性可能是導致SAD 的危險因素，但在已經(jīng)確定的20多個基因中，確認是SAD風險基因的只有載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）基因［32］。

3 AD動物模型

動物模型的建立和研究有助于AD生物學機制的認識，還可以幫助評估新藥物與AD疾病相關表型之間的因果關系［33］。因此，動物模型是開發(fā)各種治療藥物的必要工具。值得注意的是，盡管部分動物和人類有著高度相似的生理特性，但仍然存在物種差異。因此，驗證動物模型是否適用于研究目的是必需的。

嚙齒動物（包括大鼠、小鼠等）和各種非人靈長類動物是用于研發(fā)AD等藥物的典型動物。對嚙齒動物的行為研究有悠久歷史，已有很多豐富的研究數(shù)據(jù)庫便于參考，而且成本低。其他物種包括線蟲、果蠅、雞、青蛙、斑馬魚、犬、貓、山羊、狼獾、狐猴、兔、豚鼠、敘利亞倉鼠、綿羊、黑猩猩、北極地松鼠和黑熊也被認為是人類AD/癡呆癥的實驗模型。但是上述動物或多或少存在一些問題，譬如有些動物不表現(xiàn)與人類AD疾病相似的行為，有些動物存在成本、倫理或?qū)＠麊栴}，應用有限。

動物模型必須具有穩(wěn)定性且可重復。用于研究AD的動物模型可分為自然模型（natural models）、遺傳修飾 模 型（genetically modified models） 和 誘 導 模 型（induced models）三類。這三類模型各有優(yōu)缺點（表1）。

表1 三類阿爾茨海默病動物模型的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of three types of Alzheimer's disease(AD)animal models

3.1 自然模型

失憶是衰老最初的普遍現(xiàn)象。因此，老年動物可能被用作癡呆和記憶喪失障礙的自然模型。不同的動物（包括犬、貓、北極熊、綿羊、山羊和一些非人靈長類動物）可以自發(fā)地表現(xiàn)出與AD相關的神經(jīng)病理特性［34］。其中，一些物種（譬如犬和非人靈長類）的老年表現(xiàn)與人類的AD特性更為相似。由于自然模型不需要任何人工操作，是模擬AD自然病理生理學過程的寶貴工具［34］。

老年嚙齒動物（包括大鼠和小鼠等）通常不會自發(fā)地表現(xiàn)出AD樣病理學特征，但是一些動物可作為人類癡呆的替代模型，用于評估認知功能障礙。譬如，快速衰老的SAMP8 品系小鼠是研究AD 的理想模型［35］。該品系小鼠不但表現(xiàn)出年齡相關的學習記憶障礙，而且表現(xiàn)出AD發(fā)病機制的大部分特征，包括抗衰老因子、氧化應激、炎性因子異常表達、Aβ 沉積、Tau過度磷酸化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、自噬活性異常和腸道菌群破壞等［35］。快速老化癡呆模型小鼠SAMP8 是快速老化小鼠（senescence accelerate mouse，SAM）的一個亞系。SAM 小鼠是日本京都大學培育的一種近交系衰老模型鼠，已廣泛用于衰老相關性疾病的研究［35］。

3.2 遺傳修飾模型

AD 遺傳修飾模型是根據(jù)與FAD 或SAD 相關的易感基因設計而成，主要集中在APP、PSEN1、微管相關 蛋 白 Tau （microtubule-associated protein Tau，MAPT）、髓樣細胞表達觸發(fā)受體-2 （triggering receptor-2 expressed on myeloid cells， TREM2） 和APOE［36-38］。迄今為止，已開發(fā)出近170個AD轉(zhuǎn)基因/敲入/敲除模型（具體可以參見ALZForum 數(shù)據(jù)庫：https：//www.alzforum.org/research-models）。除TREM2、APOE 外，這些模型幾乎完全集中在淀粉樣蛋白上，Tau相關轉(zhuǎn)基因較少。表2列出了15種常用的小鼠遺傳修飾AD模型。

表2 15種常用的小鼠阿爾茨海默病遺傳修飾模型Table 2 15 common genetically modified mouse models of Alzheimer's disease(AD)

如何從170種左右的AD動物模式中選出最合適的模型，將是一個比較大的挑戰(zhàn)，需要綜合考慮。其中必須注意以下幾點：（1）沒有一種動物模型能夠完全再現(xiàn)人類AD 發(fā)病機制中觀察到的所有認知缺陷；（2）每種小鼠模型都能模擬AD相關的某些方面；（3）不同的小鼠模型之間，其認知缺陷發(fā)生的時間和嚴重程度各不相同；（4）大多數(shù)模型的空間工作記憶的缺陷早于其他認知領域的缺陷；（5）大多數(shù)使用AD小鼠模型的研究都集中利用行為學研究與AD 相關的認知缺陷。然而，考慮到AD是一種復雜的疾病，各種非認知癥狀也會對不同的AD小鼠模型產(chǎn)生或多或少的影響，因此在評估行為表型時，各種非認知癥狀應與疾病的認知缺陷一起考慮。

3.3 誘導模型

根據(jù)顱內(nèi)注射化學物質(zhì)是否直接引起特定腦區(qū)誘發(fā)病變的差異，AD誘導模型可以分為化學誘導模型和損傷誘導模型［39］。可以經(jīng)腦部注入特定的物質(zhì)影響神經(jīng)遞質(zhì)途徑，阻滯神經(jīng)元，導致動物癡呆，從而建立化學誘導模型，例如Aβ 或東莨菪堿誘導的遺忘模型。通過外科手段在側(cè)腦室或腦實質(zhì)內(nèi)注射微量神經(jīng)毒物質(zhì)（如NMDA、鵝膏蕈氨酸和膽堿毒素AF64）引起腦部病變，可建立損傷誘導模型，該模型有助于了解膽堿能神經(jīng)支配在認知功能障礙中的作用機制［38］。表3列出了AD誘導模型使用各種興奮性毒素對膽堿能途徑的化學損傷，或者是基于缺氧和（或）中風誘導的模型。

表3 常用的阿爾茨海默病誘導模型Table 3 Common intervention models of Alzheimer's disease(AD)

4 AD動物模型的評價指標

AD 動物模型主要從以下幾個方面進行評價：（1）分子病理學或組織病理學特征測試，用于證實Aβ 斑塊、Tau蛋白的細胞內(nèi)聚集體、氧化損傷以及大腦皮層和某些大腦皮層下區(qū)域的突觸和神經(jīng)元損失；（2）行為測試，用于評價動物認知缺陷狀況。一般利用常規(guī)的分子指標分析就可以實現(xiàn)分子病理學或組織病理學測試，如蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學染色和實時定量PCR。以下重點介紹動物行為評價和無創(chuàng)檢測手段。

4.1 動物行為評價

在評估某種化合物是否具有改善認知功能作用時，行為測試結果通常是衡量指標，因為這些指標的變化與AD相關的認知功能障礙直接相關。如何在動物（如嚙齒動物和非人靈長類動物）中有效地測量AD引起的認知障礙，對AD 發(fā)病機制及藥物發(fā)現(xiàn)都非常重要［40-41］。表4列舉了5種對AD動物模型進行行為測試的實驗方法，主要測試動物的空間記憶行為（Morris水迷宮、放射臂迷宮和巴恩斯迷宮）、聯(lián)想學習（場景恐懼實驗）、新物體再認記憶（新物體識別實驗）。

表4 阿爾茨海默病動物模型的行為測試實驗Table 4 Behavioral validation tests for animal models of Alzheimer's disease(AD)

但需要注意的是，與AD表型相關的生化指標變化相比，行為測試的結果一致性較差，需要更加嚴格的實驗要求，包括小鼠品系、性別、年齡、是否是同一窩出生的小鼠、實驗環(huán)境等。即使行為評價模型是標準化的，各種模型之間的行為數(shù)據(jù)也可能難以比較。

4.2 成像系統(tǒng)

神經(jīng)成像技術提供了一種非常好的無創(chuàng)性檢測方法，在臨床前和臨床研究中發(fā)揮著重要作用［42-43］。最常見的腦成像方法是磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI） 和正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography，PET）。MRI 利用磁場和無線電波（不使用放射性示蹤劑）能夠提供良好的對比度圖像。結構磁共振成像（structural MRI，sMRI）可以檢測到AD 腦組織的大小變化［44］；功能磁共振成像（functional MRI，fMRI）可識別與神經(jīng)活動相關的血流動力學反應，表征神經(jīng)系統(tǒng)疾病［45］。MRI不能直接識別AD的分子病理學或組織病理學特征，但是PET可以直接檢測AD 的分子病理學特征［46-47］。因此，與MRI相比，PET 具有更大的優(yōu)勢。PET 是一種無創(chuàng)成像技術，可與放射性標記物相結合，評估Aβ在腦部沉積量的情況、代謝負荷以及葡萄糖下降率等。盡管神經(jīng)影像學方法有許多優(yōu)點，但也存在局限性［47］，例如PET檢測手段成本高、存在放射性污染和對放射性過敏的風險。

5 展望

AD 嚴重影響全世界老年人的健康，是一種多病因、病理學極其復雜的疾病。目前還沒有找到AD的真正致病原因，因此也沒有能夠真正有效治療的藥物。根據(jù)AD 最主要的神經(jīng)病理學特征即在大腦部位形成Aβ斑塊，研究人員提出了淀粉樣蛋白假說，已構建了170 多種“Aβ 斑塊”動物模型，并利用這些模型測試了許多阻止腦淀粉樣蛋白沉積或清除已有淀粉樣蛋白斑塊的化合物，但是這些化合物一旦進入臨床試驗階段均因無臨床療效而不得不放棄［48］。因此，在大腦中過度表達各種形式的人類淀粉樣蛋白的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因動物更像是一種導致AD的病理學模型。

值得一提的是，最近《科學》雜志發(fā)表了一篇詳盡的調(diào)查報告，稱2006 年Sylvain Lesné 等發(fā)表在《自然》雜志上的一篇文章涉嫌造假［49］。該論文主要證明相對分子質(zhì)量為56 000的可溶性Aβ寡聚物形式（命名為Aβ*56）在老年AD 模型小鼠Tg2576 腦部沉積是該小鼠發(fā)生記憶缺陷的原因。上述工作是第一次在動物體內(nèi)純化獲得一種特定的Aβ寡聚物形式，并證明了其對神經(jīng)的毒性，因此，該工作造假會對淀粉樣蛋白假說形成一定“沖擊”，讓一些研究者更加嚴謹、客觀地看待Aβ斑塊在AD發(fā)生中的作用。但Aβ*56只是Aβ寡聚物的一種，并非AD患者腦部表達最多的Aβ。目前，AD研究領域公認的是Aβ40和Aβ42，也是研究最多的兩種Aβ寡聚形式。因此，上述造假事件可能并不會影響淀粉樣蛋白假說，或許針對Aβ開發(fā)藥物的不斷失敗才真正讓人們開始懷疑它的正確性。

有研究表明，在非人靈長類動物AD模型中去除大腦的Aβ 斑塊并沒有改善靈長類動物的認知狀態(tài)［50］。因此，建議在臨床試驗前，先在非人靈長類動物模型中測試相關的AD候選藥物，以避免臨床試驗失敗帶來的巨額成本。但需要注意，目前對非人靈長類動物AD病理特征的研究不多，有些國家存在動物倫理的爭議，而且非人靈長類動物成本昂貴，上述因素均需要研究者在采用這類模型時綜合考慮。此外，通過行為測試評價認知障礙的結果可能不夠精準，需要進一步改善，一般至少需要兩個行為測試來評估某化合物是否具有改善行為認知的能力。

總之，雖然目前已經(jīng)有多達200多種的AD動物模型，但基于淀粉樣蛋白假說開發(fā)的藥物在臨床試驗中證明失敗，提示研究者們需要開發(fā)出更多非“Aβ 斑塊”動物模型，譬如更接近人類發(fā)病機制的自然模型。希望這些新開發(fā)的模型能幫助人們更好地理解AD疾病的復雜致病機制，并幫助找到真正有效的治療AD的藥物。另外，還需要開發(fā)出更多的模型或?qū)嶒灧椒▉碓u估行為認知，如嗅覺障礙模型［51］，因為嗅覺障礙是AD的一個關鍵特征，它可能比Morris水迷宮、放射臂迷宮和巴恩斯迷宮更能反映AD動物的認知情況。

[作者貢獻Author Contribution]

盛哲津檢索文獻，并制作所有表格；李利妹撰寫和修改文稿。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。