野牛草ISSR 分子標記體系的優化及遺傳多樣性分析

袁紅，王羽玥，郭愛強，劉凌云，范希峰，武菊英

（1. 天津濱海國際機場有限公司，天津 300300；2. 北京市農林科學院，北京 100097）

野牛草（Buchloe dactyloides），禾本科畫眉草亞科野牛草屬，多年生暖季型草，多為雌雄異株，原產北美干旱半干旱矮草原［1-2］。20 世 紀40年 代 作 為 水 土 保持植物引入我國，表現出良好的適應性。野牛草具有葉片質地柔軟、植株低矮、匍匐莖廣泛延伸等特點，更由于其極強的耐旱性，目前廣泛應用于草坪地被、園林綠化、固土護坡等［3］。當前對野牛草的研究主要集中在品種選育［4］、抗逆生理［5-7］及表型鑒定［8］等方面。而目前在遺傳多樣性研究上，存在資源少、方法不完善等問題，因此，進行分子標記方面的研究愈發必要。

前人利用同工酶譜、隨機擴增多態性DNA 標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、序列相關擴增多態性（Sequence?related amplified polymor?phism，SRAP）和簡單重復序列區間擴增（Inter simple sequence repeat，SRAP）對野牛草開展了遺傳多樣性的研究，探析了部分種質資源的遺傳多樣性。李永祥［9］通過RAPD 分子標記和幼葉PPO 同工酶譜兩種方法對野牛草雄性植株早期性別鑒定。周瑩潔［10］通過分子標記在雌性植株中找到特異性條帶，但篩選標記的工作量及材料的不確定性仍造成了野牛草性別鑒定的困難。成凱凱等［3］通過ISSR 分子標記對美國及中國收集的30 份野牛草資源進行坪用性狀的觀測及遺傳多樣性分析，證明ISSR 一定程度上可以揭示野牛草材料的遺傳背景。

ISSR 作為分析遺傳多樣性的一種簡便快捷的方法，被廣泛應用到種質資源鑒定、輔助育種選擇、遺傳圖譜建立等領域［11］。ISSR 標記具有操作簡單、可靠性強、重復性高、DNA 模板用量少、不需預先設計引物的特點，可用來揭示樣本間的遺傳多樣性［12-13］。近年來，已在鴨茅（Dactylis glomerata）［14］、黑麥草（Lolium persicum）［15］及早熟禾（Poa annua）［16］等禾本科草上廣泛應用。盡管ISSR 分子標記在野牛草中的應用已有報道，但是在實際操作的過程中，擴增體系及條件受多因素影響，存在一定的局限性，因此需要根據實驗室的客觀條件進行優化。

天津濱海國際機場東跑道升降帶中分布有野牛草資源，經過多年馴化形成了數個零星分布的斑塊狀草坪群落。連續多年觀測發現其中一個純雌株群落表現出非常強的適應能力，且具備植株低矮、不結籽、病蟲害少、抗逆性強等符合機場安全運行和鳥擊防范要求的多重特征。但該材料遺傳背景不清，且量小，不足以支撐生產和推廣。為進一步明確其遺傳信息，篩選相近的種質資源進行擴繁，提升機場綠化和鳥防效果，本研究利用ISSR 標記探析其遺傳背景。首先優化ISSR 體系，主要包括TaqPCR Mix、引物、模板DNA 的配比及PCR 反應體系的摸索。然后通過ISSR 分子標記的方法對收集的39 份野牛草資源進行遺傳多樣性分析，并選擇親緣關系相近、性狀優良的材料用于后續的生產擴繁。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料為課題組收集到的39 份野牛草資源，收集地包括天津濱海國際機場、中國林業科學院、中國農業科學院和北京市農林科學院等保存的野生種及6份商品化材料（表1）。

表1 39 份野牛草材料來源Table 1 Background information of the 39 buffalograss germplasms

實驗試劑：CTAB 溶液、DNA Marker、PCR Mix（天根）、瓊脂糖凝膠、Goldview 等。ISSR 引物為加拿大的不列顛哥倫比亞大學公布的序列［17］，本研究選用UBC808、UBC834、UBC836、UBC840、UBC841 和UBC889，由睿博生物工程有限公司（北京）合成（表2）。

表2 ISSR 通用引物名稱及序列信息Table 2 Name and sequence of ISSR primers

1.2 方法

1.2.1 野牛草基因組DNA 的提取 參照CTAB

法［18］改良后進行野牛草基因組DNA 的提取。用1%的瓊脂糖檢測DNA 質量，用紫外分光光度計檢測所提DNA 的 濃 度 及OD值。 將DNA 統 一 稀 釋 到20 ng/μL，存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 ISSR體系的建立及優化 本實驗體系中主要影響因素為TaqPCR Mix、模板DNA、引物濃度，其次為PCR過程中的退火溫度、循環數及延伸時間等。

根據實驗室對苔草SSR 分子標記體系的探究［19］，本實驗野牛草PCR 反應體系根據3 因素的3 個水平設計正交實驗（表3，4），剩余用ddH2O 補齊，配制總體積為10 μL 的反應體系。隨機引物選取UBC808。

表3 野牛草ISSR 體系因素水平設計Table 3 Experiment design of ISSR system factors of buffalograss

PCR 擴增體系為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34 個循環；72 ℃繼續延伸10 min；4 ℃保存。PCR 產物通過1%的瓊脂糖凝膠進行分離，并在凝膠成像系統拍照保存。

表4 野牛草ISSR 體系正交設計實驗Table 4 Orthogonal experiment design of ISSR system of buffalograss

1.2.3 PCR 擴增體系優化 根據上述操作得到反應的最佳體系配比，并以此進行退火溫度的梯度摸索。由于不同引物的最佳退火溫度不同，這里以UBC808為例，選取野牛草品種“中坪1 號”，設置3 個梯度分別為48、51、54 ℃，進行最佳退火溫度的確定。

1.2.4 數據分析 對獲得的瓊脂糖凝膠結果進行人工讀帶，在同一Marker 大小下，39 份樣品的擴增結果有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，統計所有引物下的條帶，形成原始數據矩陣表。利用NTSYS Version 2.1［20］及POPGENE 32［21］計 算 遺 傳 參 數，并 繪 制UPMGA 遺 傳 信 息 聚 類 圖［22］。根 據 公 式PIC=1-∑jiPij2［23］計算多態性信息含量（PIC），其中Pi表示第i個位點的等位基因頻率，Pj表示第j個位點出現的頻率。

2 結果與分析

2.1 野牛草ISSR 體系優化結果

野牛草ISSR 分子標記以TaqPCR Mix、模板DNA、引物濃度為因素，每個因素設計3 個水平，正交試驗共得到9 個實驗組合。根據PCR 產物的瓊脂糖凝膠結果（圖1），9 個組合均得到多態性條帶，根據各成分用量的不同擴增結果出現不同程度的差異。其中，1~3 號條帶模糊，4~9 號均擴增出清晰條帶。以5號和9 號的擴增效果最佳，考慮成本問題及模板的用量等，以5 號體系為基礎進行后續PCR 反應條件的優化。

圖1 正交實驗1~9 組合擴增結果Fig.1 Amplification results of orthogonal test combination

不同退火溫度得到的擴增結果顯示，產物條帶在退火溫度為48 ℃時最亮，51、53 ℃時差別不明顯，但較48 ℃的條帶相比較弱（圖2）。

圖2 退火溫度為48、51 和53℃的擴增結果Fig.2 Amplification results at annealing temperature 48，51 and 53 ℃

最終確定的優化體系為10 μL 體系，其中包括5.0 μL Mix、20 ng/μL 的DNA 模 板2 μL 以 及 引 物0.6 μL，并以94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34 個循環；72 ℃繼續延伸10 min；4 ℃保存的PCR 擴增體系擴增，可以作為其余39 份樣品的ISSR 分析的基礎。

2.2 遺傳多樣性分析

通過篩選前期合成的ISSR 通用引物，最終確定6對引物對39 份野牛草材料進行遺傳多樣性分析。PCR 產物通過瓊脂糖凝膠電泳，共擴增出39 條條帶（部分擴增結果見圖3），產物條帶的分子量分布在500~2 000 bp。利 用NTSYS-PC V2.1 軟 件，分 析得到野牛草材料間的平均遺傳距離為0.428，遺傳相似系數為0.572。使用POPGENE 32 計算分析了觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、基因多樣性指數（H）以及Shannon 信息指數（I）（表5）。多態性信息含量平均為0.303，在0.250~0.500，遺傳多樣性參數顯示野牛草材料之間的遺傳多樣性處于中等水平，遺傳基礎較寬。

表5 39 份野牛草材料的遺傳多樣性參數Table 5 Genetic diversity parameters of the39 buffalograss

圖3 引物UBC836 對39 份野牛草材料的擴增結果Fig.3 Amplification results of primer UBC836 among the 39 buffalograss materials

2.3 聚類分析

對39 份野牛草材料的ISSR 數據進行UPGMA 聚類分析，共分為兩大類，其中27 號和28 單獨聚為一類，其余36 份被聚到一類（圖4）。其中與機場收集到的1 號材料親緣關系較近的為21 號、9 號和3 號，24 和25 號親緣關系最近。聚類分析表明39 份野牛草具有明顯遺傳背景的差異，在遺傳距離為0.47 時，可將其劃分為6 組，其中第1 組包含22 份材料，其中包括10份雌株，5 份雌雄株，占該組的68.2%；第2 組7 份雄株，2 份雌雄株，占該組的75.0%，可以大致上對雌雄株進行粗略的劃分。同時采集自天津機場的1-6 號材料可以聚到一類，但同時也混合了采集自北京的材料，說明地域來源對其的影響不大。

圖4 39 份野牛草材料遺傳多樣性分析Fig.4 Genetic diversity analysis of the 39 buffalograss germplasms

3 討論

本研究提供了一種快速高效的野牛草ISSRPCR 反應體系，相比于張曉波等［24］對ISSR 體系探究，本研究用到的正交設計實驗可以較快的找到最佳組合，并使用含有高純度的TaqDNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液等物質的預混液TaqPCR Mix，在提高實驗效率的同時，也減少了dNTP、Taq酶及Mg2+的配比對體系的影響。具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩定性好等優點。

引物的退火溫度也是影響體系的重要因素。在芒草（Miscanthus sinensis）中ISSR 通用引物的退火溫度 為52~54 ℃［25］，苔 草 屬（Carex）植 物 為51~55 ℃［17］，本研究確定的最佳退火溫度為48 ℃，與其他研究相比偏低。周少云等［26］提出不同植物材料的退火溫度存在差異，針對不同的植物材料還應通過梯度試驗進行最終確定。

盡管ISSR 分子標記技術已十分成熟，但具體到某一植物材料仍需進行體系的摸索與探究。野牛草是暖季型草坪草中的重要研究材料，應用前景廣闊［27］，因此本研究同時關注野牛草材料的收集與遺傳多樣性分析，為野牛草育種應用、遺傳改良等提供分子基礎。

通過遺傳多樣性及聚類分析，本研究挑選21 號種質資源進行后續的擴繁實驗，根據劉莉［28］對20 株野牛草進行的表型及ISSR 分析得到，聚類結果與形態特征沒有明確的相關關系，所以在肉眼識別的外觀性狀均優良的條件下，可以選擇與目的材料遺傳距離較近的材料擴繁。本研究中的平均遺傳距離為0.428，低于SRAP 標 記的0.669［1］，說明 本 研 究 用到的39 份野牛草材料更具相似性。

地域對種質資源的聚類有一定影響，但并未在本研究中體現，這與周瑩潔等［1］來自3 個國家的31 份野牛草材料進行UPGMA 聚類發現的結果一致。本研究中并未發現地域對分類規律的影響原因可能有以下兩點：一是收集地少，并且地域距離較近，具有相似的生境；二是收集的材料不具有地域的代表性，可能為引種或者商品化品種。

通過UPGMA 聚類并未完全對雌雄株進行清晰的劃分，原因之一是本研究的目的是尋找與機場雌株遺傳背景相似的材料進行擴繁，并未特意對可以鑒別雌雄株的ISSR 引物進行篩選；二是ISSR 可能不適合對野牛草進行性別鑒定，需要研究開發不同類型的分子標記進行研究。

4 結論

確定野牛草的ISSR 最佳反應體系為：5.0 μLMix、40 ng DNA 模板、0.6 μL 引物（1.0 μmol/L）及ddH2O 補齊。最佳擴增條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將39 份野牛草材料的遺傳多樣性進行聚類分析，材料可分為兩大類，其中21 號材料和天津濱海國際機場候選雌性野牛草材料的親緣關系最近，可以作為后續材料擴繁和生產的種質資源。本研究中ISSR 體系的探索與優化、遺傳多樣性分析為野牛草遺傳多樣性分析工作提供了依據。