白三葉不同部位水浸提液對草地早熟禾的化感作用

楊小妮，白小明，李萍，康瑞卿，鄭萬菊，田曉嵐

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中?美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

白三葉（Trifolium repense），又名白車軸草，是豆科車軸草屬的多年生草本植物，現(xiàn)廣泛分布于溫帶及亞熱帶高海拔地區(qū)。白三葉具有生長迅速、成坪快、綠期長、適應(yīng)性廣等優(yōu)點，常被用作觀賞性草坪草和優(yōu)質(zhì)飼草，在我國北方景觀草坪中其建植面積占比達到15%［1］。草地早熟禾（Poa pratensis）是一種超低矮的草類植物，具有極強的耐寒性、抗高溫性和抗病蟲害等特點，其草坪綠期長，應(yīng)用范圍極廣。單一草坪存在高度的均一性，具有較好的觀賞效果。但是其單一性導(dǎo)致生物多樣性較差，且草坪建植穩(wěn)定性較低。此外，許多單一草坪由于建植與管理不當(dāng)，使草坪的觀賞價值降低，使用壽命縮短，造成一定的經(jīng)濟損失。混播草坪能夠適應(yīng)差異較大的環(huán)境條件，增強草坪的抗逆性，加快成坪速度，延長草坪綠期和壽命。在我國北方地區(qū)，為延長城市綠化中草坪綠期，常將白三葉與冷季型草坪草，如草地早熟禾、多年生黑麥草（Lolium perenne）、高羊茅（Festuca elata Keng ex）等混播［2-4］。在草坪建植方面，白三葉通過根瘤菌固氮為禾草提供生長所需的氮素營養(yǎng)，禾草可使白三葉免受其他雜草競爭，同時草坪草混播可有效利用陽光，使草坪獲得較為理想的覆蓋度。在人工草地種植方面，禾本科和豆科牧草的混播以其提高飼草產(chǎn)量、改善飼用品質(zhì)、減少土壤侵蝕、降低病蟲害等優(yōu)勢在世界上許多地區(qū)備受重視，特別是溫帶或亞熱帶地區(qū)。但白三葉存在較強的化感作用，對高羊茅、多年生黑麥草、鴨茅（Dactylis glomerata）等的生長造成一定程度的影響［4］。李劍鋒等［7］研究表明，白三葉對禾草草坪具有很強的侵占性，能夠在禾草草坪上形成小群落，逐漸擴展并取代禾本科草坪草，破壞草坪園林景觀原有的形態(tài)和功能。

化感作用是植物通過根、莖、葉等器官向環(huán)境釋放次生代謝產(chǎn)物并對周圍其他植物或者自身產(chǎn)生抑制或促進作用。研究表明，許多植物物種對其他植物物種具有化感作用，如白三葉根、莖、葉等對鴨茅、多年生黑麥草、彎葉畫眉草（Eragrostis curvula）等植物都存在抑制或促進的化感作用［8-10］。白三葉+禾本科草坪草混播草地是我國北方地區(qū)草地建植中的常見組合，其混播中的化感作用受到廣泛的關(guān)注［7-9］。目前，白三葉對冷季型草坪草化感作用研究主要集中在植株浸提液、腐解液、根系分泌物、揮發(fā)物等對受體植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響［11-14］。李志華等［15］研究了白三葉莖、葉對一些常見牧草的化感效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其不同濃度的浸提液對受試牧草的種子萌發(fā)和幼苗生長具有顯著的促進或者抑制效應(yīng)［16］。在白三葉和草地早熟禾混播草坪建植過程中，草地早熟禾種子經(jīng)常出現(xiàn)萌發(fā)率低、根系發(fā)育不良、幼苗弱小甚至枯萎等現(xiàn)象。此前關(guān)于草地早熟禾種子萌發(fā)的研究，主要集中在破除休眠、溫度、光照等方面，而關(guān)于白三葉對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用研究鮮見報道。本研究探討了白三葉不同部位水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在明確混播草地（白三葉+草地早熟禾）中白三葉對其他草坪草的化感作用機理，為我國人工混播草坪建植與利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供體植物白三葉植株采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)牧草實訓(xùn)基地，受體植物草地早熟禾品種為公牛，購自甘肅百綠草業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理 2020年5月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)牧草實訓(xùn)基地，采用隨機取樣的方法，采集3 a 齡返青期的白三葉新鮮完整植株帶回實驗室。將采集的白三葉植株去除雜質(zhì)，用無菌蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干水分后，分離白三葉根、莖、葉，備用。

1.2.2 白三葉水浸提液的制備 分別稱取50 g 洗凈的白三葉根、莖、葉樣品，用蒸餾水沖洗干凈，用酒精消毒的剪刀剪成1~2 cm 的小段，倒入三角瓶中，加入500 mL 無菌蒸餾水，室溫浸泡48 h（每隔12 h 用玻璃棒攪拌1 次），用漏斗過濾，得到濃度為0.1 g/mL 的白三葉水浸提液。將該浸提液用無菌蒸餾水稀釋為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 g/mL 濃度的溶液，保存于4 ℃冰箱，備用。

1.2.3 草地早熟禾種子萌發(fā)試驗 采用培養(yǎng)皿濾紙法進行種子萌發(fā)試驗。用0.1% HgCl2溶液浸泡草地早熟禾種子，消毒20 min，然后用自來水沖洗，再用無菌蒸餾水洗2~3 次。選擇大小均一、籽粒飽滿的草地早熟禾種子50 粒，均勻置于鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，分別加入不同濃度（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 g/mL）白三葉水浸提液5 mL，以無菌蒸餾水處理為對照，每個處理重復(fù)3 次。將加有受體種子的培養(yǎng)皿放入人工培養(yǎng)箱（SPX?GB），溫度為20 ℃晝/18 ℃夜，光周期為16 h 晝/8 h 夜，每隔24 h 觀察并記錄種子發(fā)芽數(shù)（胚根或胚軸突破種皮1~2 mm 時為萌發(fā)），統(tǒng)計發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。試驗期內(nèi)適量補充蒸餾水保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)計算公式如下：

發(fā)芽率（GR）=（第28 d 的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）×100

發(fā)芽勢（GE）=（發(fā)芽初期14 d 正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt）

式中：Gt 為不同時間發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)；

活力指數(shù)（VI）=GI× S（S 為第14 d 測得的整株鮮重（g）。

在人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)28 d 后，從每個培養(yǎng)皿隨機挑選5 株長勢均勻的幼苗，用濾紙吸干水分，分別測定其幼苗長、幼苗鮮重和幼根長，幼苗長和幼根長用直尺測量，幼苗鮮重用電子天平稱量。

化感效應(yīng)指數(shù)（RI）=1-C/T（T≥C）或RI=T/C-1（T

當(dāng)RI>0 時，為促進作用；當(dāng)RI<0 時，為抑制作用，RI 絕對值的大小表示化感作用強度。

化感綜合效應(yīng)用上述幾個測量指標(biāo)的化感效應(yīng)指數(shù)的平均值進行評價［17］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 整理數(shù)據(jù)；采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，并用Duncan 法對各處理數(shù)據(jù)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉根、莖、葉水浸提液對草地早熟禾種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

白三葉不同部位不同濃度水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)影響不同（表1）。白三葉根、莖水浸提液，隨著濃度的增加，草地早熟禾種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈先上升后下降的趨勢。0.02 g/mL 的根水浸提液和葉水浸提液處理的草地早熟禾種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均高于對照，但與對照差異不顯著（P>0.05）。0.08 g/mL 的根、莖和葉水浸提液的草地早熟禾種子發(fā)芽率較對照均分別減少，種子發(fā)芽勢較對照也均減少（P<0.05），對草地早熟禾抑制作用最強。除0.02、0.04 g/mL 的根水浸提液和莖水浸提液和0.02 g/mL的葉水浸提液處理的草地早熟禾種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢與對照差異不顯著（P>0.05）外，其他濃度根水浸提液、莖水浸提液以及葉水浸提液均與對照差異顯著。白三葉葉水浸提液對草地早熟禾的發(fā)芽勢整體呈顯著抑制作用（P<0.05）。白三葉不同部位水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)抑制作用的強弱順序為：根>莖>葉。

表1 白三葉水浸提液對草地早熟禾種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢Table 1 Effect of aqueous extracts from different parts of white clover on the seed germination rate and germination force of Kentucky bluegrass

2.2 白三葉根、莖、葉水浸提液對草地早熟禾發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

白三葉不同部位不同濃度水浸提液對草地早熟禾發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)影響不同（表2）。白三葉葉、根和莖水浸提液，隨著濃度的增加，草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈先上升后下降的趨勢。0.02 g/mL 的葉水浸提液和0.04 g/mL 的根水浸提液處理的草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù)分別較對照增加9.59%和17.46%；0.08 g/mL 的根、莖和葉水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)抑制作用最強（P<0.05），0.08 g/mL的根、莖和葉水浸提液的草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù)較對照分別減少25.52%、21.42%和23.35%，種子活力指數(shù)較對照分別減少11%、8%和1%。0.02、0.04、0.06 g/mL 的 根水浸提液和0.02、0.04 g/mL 的莖水浸提液處理的草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù)與對照差異不顯著（P<0.05），0.02 g/mL 的根水浸提液和0.02、0.04、0.06 g/mL 的莖水浸提液處理的草地早熟禾種子活力指數(shù)與對照差異不顯著外，其他濃度根水浸提液、莖水浸提液以及葉水浸提液均與對照差異顯著。不同部位白三葉水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)抑制作用的強弱順序為根>葉>莖。

表2 白三葉水浸提液對草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)Table 2 Effect of aqueous extracts from different parts of white clover on the seed germination index and germination vigor index of Kentucky bluegrass

2.3 白三葉根、莖、葉水浸提液對草地早熟禾種子幼苗長、幼苗鮮重和幼根長的影響

白三葉不同部位不同濃度水浸提液對草地早熟禾幼苗生長影響不同（表3）。隨著同一部位白三葉水浸提液濃度的增加，草地早熟禾種子幼苗長，幼苗鮮重和幼根長呈先上升后下降的趨勢。與對照相比，低濃度的白三葉不同部位水浸提液對草地早熟禾的幼苗長、幼苗鮮重、幼根長無顯著影響，高濃度的白三葉不同部位水浸提液則顯著抑制草地早熟禾幼苗長、幼苗鮮重、幼根長的增加。0.02 g/mL 的莖、葉水浸提液處理幼苗長高于對照，但差異不顯著；0.02 g/mL 的根水浸提液對幼根長高于對照，但差異不顯著；0.01 g/mL 的根、莖水浸提液處理幼苗鮮重高于對照，但差異不顯著。0.08 g/mL 的根、莖和葉水浸提液對草地早熟禾幼苗生長抑制作用最強，與對照差異顯著，0.08 g/mL 的根、莖和葉水浸提液的草地早熟禾種子幼苗長分別較對照減少1.45、1.54、1.55 mm，種子幼根長分別較對照減少4.13、4.17、4.58 mm，種子幼苗鮮重分別較對照減少0.001 6、0.001 8、0.001 6 g。0.08 g/mL 的根、莖水浸提液和除0.02 g/mL 之外的其他濃度的葉水浸提液處理的草地早熟禾幼苗長與對照差異顯著；0.08 g/mL 的根、莖水浸提液和所有濃度的葉水浸提液處理的草地早熟禾幼根長與對照差異顯著；0.08 g/mL 的根水浸提液、除0.01 g/mL 之外其他濃度的莖水浸提液和0.06 g/mL、0.08 g/mL 的葉水浸提液處理的草地早熟禾幼苗鮮重與對照間差異顯著；其他濃度根、莖和葉水浸提液處理的草地早熟禾幼苗長、幼根長和幼苗鮮重與對照間差異不顯著；白三葉不同部位水浸提液對草地早熟禾幼苗生長抑制作用的強弱順序為葉>莖>根。

表3 白三葉水浸提液處理下草地早熟禾種子幼苗長、幼根長和幼苗鮮重Table 3 Effect of aqueous extracts from different parts of white clover on the lengths seminal of seeding and seminal root，and the weight of seminal of seeding of Kentucky bluegrass

2.4 白三葉根、莖、葉水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長化感作用的綜合效應(yīng)

白三葉3 個部位不同濃度的水浸提液對草地早熟禾種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗長、幼苗鮮重和幼根長的化感指數(shù)多為負值（表4），說明白三葉不同部位水浸提液處理對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長多表現(xiàn)為化感抑制作用，并且呈明顯的濃度效應(yīng)，即隨著水浸提液質(zhì)量濃度的升高而抑制作用逐漸增強。不同質(zhì)量濃度白三葉根、莖、葉水浸提液對草地早熟禾的化感作用強弱順序基本一致，均表現(xiàn)0.02 g/mL 濃度水浸提液的抑制作用最弱，0.08 g/mL 濃度水浸提液的抑制作用最強。相同質(zhì)量濃度下，白三葉3 個部位化感的綜合效應(yīng)依次為：葉>根>莖，表明白三葉根可能是化感物質(zhì)產(chǎn)生的主要部位。

表4 白三葉水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長化感作用的綜合效應(yīng)Table 4 Allelopathic effect of aqueous extracts from different parts of white clover on the seed germination and seedling growth of Kentucky bluegrass

3 討論

化感物質(zhì)存在于所有的植物器官中，且必須經(jīng)過合適的途徑釋放到環(huán)境中，才能對其他植物或微生物起到化感促進或化感抑制作用［19］。本試驗中，隨著白三葉水浸提液濃度的增加，受體植物草地早熟禾的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)出現(xiàn)不同程度的降低。隨著白三葉不同部位水浸提液濃度的增加，草地早熟禾種子萌發(fā)指標(biāo)值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與紫花苜蓿（Medicago sativa）莖葉水浸提液對受體植物多花黑麥草、高羊茅、白三葉和紅三葉（Tri?folium pratense），蘆葦（Phragmites australias）水浸提液對受體植物虉草（Phalaris arundinacea），海法白三葉水浸提液對雜三葉（T. hybridum）、哈默大葉紅三葉（T. pratense‘Grasslands Hamua’）、二倍體鴨茅（Dac?ty lti sglomerata）等種子萌發(fā)的影響結(jié)果相似［20-24］。在0.02 g/mL 時對草地早熟禾種子萌發(fā)抑制作用最弱，在0.08 g/mL 時對草地早熟禾種子抑制作用最強。白三葉不同部位對草地種早熟禾的化感作用不同，不同部位的白三葉水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)的抑制作用強弱順序為：根>莖>葉。而劉桂霞等［25］研究指出艾蒿（Artemisia argyi）莖葉水浸提液對冰草（Agropyron cristatum）和披堿草（Elymus dahuricus）種子萌發(fā)的化感作用不明顯。這與本研究的結(jié)果不同，表明化感作用不僅與受體植物種類有關(guān)，同時與供體植物本身也有關(guān)聯(lián)。

白三葉不同部位水浸提液對草地早熟禾幼苗生長的化感作用表現(xiàn)為抑制作用，在0.02 g/mL 時對草地早熟禾幼苗生長抑制作用最弱，在0.08 g/mL 時對草地早熟禾幼苗生長抑制作用最強。馮彬等［26］研究香蒲（Typha orientalis）不同部位浸提液對4 種水生植物的化感作用，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉比其他部位具有更強的化感作用。本研究中白三葉不同部位對草地早熟禾的化感作用不同，白三葉的不同部位水浸提液對草地早熟禾種子幼苗生長的抑制作用強弱順序為：葉>莖>根。這可能是白三葉葉片水浸提液中含有酚類與萜類化合物［27］。

在對受體植物的化感效應(yīng)綜合評價中，白三葉不同部位水浸提液處理對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長多表現(xiàn)為化感抑制作用，并且呈明顯的濃度效應(yīng)，即隨著水浸提液質(zhì)量濃度的升高而抑制作用逐漸增強。0.01 g/mL 的根、莖水浸提液對幼苗鮮重化感抑制作用最弱，0.08 g/mL 的根、莖和葉水浸提液均對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長化感抑制作用最強。不同部位的白三葉水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長的化感效應(yīng)依次為：葉>根>莖。草地早熟禾種子萌發(fā)期的化感效應(yīng)要強于幼苗生長期。這與返青期白三葉對鴨茅種子萌發(fā)和幼苗生長的結(jié)果一致［28］。

考慮到白三葉對草地早熟禾存在一定程度的化感作用，且本試驗為室內(nèi)控制試驗，今后需進一步探討白三葉和草地早熟禾不同混播比例條件下，草地早熟禾對白三葉化感作用的響應(yīng)機制，以使白三葉的化感作用在草地早熟禾和白三葉混播草地建植和高效利用中發(fā)揮有利的作用。

4 結(jié)論

白三葉根、莖、葉水浸提液對草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)抑制作用，白三葉不同部位（根、莖、葉）均可釋放化感物質(zhì)。莖和葉的化感作用要強于根，白三葉的莖和葉可能是其釋放化感物質(zhì)的主要部位。白三葉同一部位水浸提液對草地早熟禾化感作用具有一定的濃度趨勢。白三葉對草地早熟禾化感作用的抑制可通過草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長狀況來表達。