丙泊酚在低氧條件下對胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及可能的機(jī)制△

戴勁，彭鐵立，余相地

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院（清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院）消化內(nèi)科，廣州醫(yī)科大學(xué)消化病研究所，廣東 清遠(yuǎn) 511500

2貴州省人民醫(yī)院麻醉科，貴陽 550001

胰腺癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。2015年全球共411 600人死于胰腺癌，其在美國惡性腫瘤相關(guān)死亡最常見原因中居第四位[1]。目前胰腺癌的主要治療方式包括手術(shù)切除、放療、化療、姑息治療或多種方法聯(lián)合治療，然而其療效在很大程度上取決于腫瘤的臨床分期和個人健康狀況[2]。手術(shù)切除依然是胰腺癌最主要的治療方式，然而手術(shù)應(yīng)激、免疫抑制和圍手術(shù)期內(nèi)環(huán)境的改變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了有利條件，是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[3]。研究表明，麻醉藥同樣可以誘導(dǎo)并參與腫瘤細(xì)胞的生理和病理過程，如細(xì)胞增殖、血管生成和細(xì)胞凋亡。一項(xiàng)回顧性研究表明，腫瘤患者手術(shù)期間以丙泊酚為基礎(chǔ)的全憑靜脈麻醉（total intravenous anesthesia，TIVA）比吸入性麻醉藥能夠顯著降低死亡率（15.6%vs22.8%）[4]。由此可以推測丙泊酚具有潛在的抗腫瘤作用。研究表明，丙泊酚可通過上調(diào)微小RNA（microRNA，miRNA）-328的表達(dá)抑制解整合素樣金屬蛋白酶8（a disintegrin and metalloproteinase domain 8，ADAM8）的表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。ADAM8在很多惡性腫瘤（包括骨肉瘤、結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌）中與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。考慮到實(shí)體瘤特征性的低氧微環(huán)境，低氧可以誘導(dǎo)ADAM8表達(dá)上調(diào)。ADAM8在侵襲性乳腺癌中的表達(dá)會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[6]。在胰腺癌中，具有抗炎作用的巨噬細(xì)胞通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和ADAM8的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[7]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討丙泊酚在低氧條件下對胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其可能的機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為Hypo組（低氧）、Hypo+P組（低氧+10 μg/ml丙泊酚）和正常組（正常培養(yǎng)）。其中Hypo組和Hypo+P組在低氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，正常組在常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 CCK 8法檢測細(xì)胞增殖能力

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。使用CCK8試劑盒檢測24、48、72 h細(xì)胞的增殖情況。采用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞在450 nm處的吸光度值并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

參照說明書使用Corning Costar Transwell Cell Culture Inserts進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。丙泊酚或?qū)φ杖軇┮掖继幚?4 h后，加入無血清培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液，密度為1×105/ml。上層小室加入100 μl細(xì)胞懸液，下層小室加入培養(yǎng)基。12 h后應(yīng)用4%的多聚甲醛固定液固定遷移的細(xì)胞，然后用結(jié)晶紫溶液染色15 min。采用熒光顯微鏡拍攝圖片。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測ADAM 8蛋白表達(dá)情況

采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，取30 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完畢后半干法轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。采用5%的脫脂奶粉室溫封閉60 min。將1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過夜，1∶1500稀釋的二抗室溫孵育120 min。采用Odyssey Imaging Systems顯影并保存圖像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算ADAM8蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對低氧條件下胰腺癌Panc- 1細(xì)胞增殖活性的影響

培養(yǎng)24、48、72 h，Hypo組胰腺癌Panc-1細(xì)胞的增殖活性均高于正常組和Hypo+P組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖1、表1）

圖1 CCK 8法檢測不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞的增殖活性

表1 不同時間點(diǎn)不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞增殖活性的比較（）

表1 不同時間點(diǎn)不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞增殖活性的比較（）

注：*與Hypo組比較，P<0.05

組別正常組Hypo組Hypo+P組1.4±0.2*1.7±0.2 1.2±0.1*2.2±0.2*3.6±0.3 1.5±0.2*3.1±0.4*4.9±0.5 1.9±0.3*24 h 48 h 72 h

2.2 丙泊酚對低氧條件下胰腺癌Panc- 1細(xì)胞侵襲的影響

Hypo組胰腺癌Panc-1細(xì)胞侵襲數(shù)目多于正常組和Hypo+P組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖2、表2）

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞的侵襲能力

表2 不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞侵襲數(shù)目的比較（）

表2 不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞侵襲數(shù)目的比較（）

注：*與Hypo組比較，P<0.05

組別正常組Hypo組Hypo+P組侵襲細(xì)胞數(shù)目12.7±3.5*23.5±4.7 8.7±2.2*

2.3 丙泊酚對低氧條件下胰腺癌Panc- 1細(xì)胞中ADAM 8蛋白表達(dá)情況的影響

Hypo組胰腺癌Panc-1細(xì)胞中ADAM8蛋白相對表達(dá)量高于正常組和Hypo+P組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖3、表3）

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞中ADAM 8蛋白的表達(dá)情況

表3 不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞中ADAM 8蛋白相對表達(dá)量的比較（）

表3 不同組別胰腺癌Panc- 1細(xì)胞中ADAM 8蛋白相對表達(dá)量的比較（）

注：*與Hypo組比較，P<0.05

組別正常組Hypo組Hypo+P組1.6±0.5*2.2±0.7 1.3±0.4*ADAM8蛋白相對表達(dá)量

3 討論

以丙泊酚為基礎(chǔ)的TIVA對改善腫瘤手術(shù)患者的預(yù)后具有重要意義，但其分子機(jī)制尚不明確[4]。研究表明，低氧環(huán)境會導(dǎo)致ADAM8過表達(dá)，并與骨肉瘤、結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌中腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[8]。低氧環(huán)境會刺激Panc-1細(xì)胞，使ADAM8的前體和活性形式都顯著上調(diào)。使用丙泊酚可以很好地抑制ADAM8在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，在低氧條件下，丙泊酚對胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力均具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，低氧條件下，丙泊酚可以抑制胰腺癌Panc-1細(xì)胞中ADAM8蛋白表達(dá)，并抑制細(xì)胞的增殖及侵襲能力。

大多數(shù)實(shí)體瘤中氧供應(yīng)和需求之間的不平衡導(dǎo)致低氧微環(huán)境，這對促進(jìn)人類惡性腫瘤的發(fā)展具有至關(guān)重要的作用[9]。越來越多的證據(jù)揭示了缺氧對胰腺癌的作用。Cao等[10]報道了缺氧通過誘導(dǎo)旁分泌骨橋蛋白/整合素αvβ3的表達(dá)來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過調(diào)節(jié)叉頭框蛋白M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）表達(dá)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生。Deng等[11]研究表明，低氧誘導(dǎo)的長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）-BX111通過調(diào)節(jié)E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。Li等[12]研究揭示了lncRNA-NORAD能夠增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移。Lu等[13]研究提出miRNA-142通過靶向腫瘤微環(huán)境中的缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Chen等[14]闡明低氧不僅能夠誘導(dǎo)TWIST蛋白激活上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，還能在體外和裸鼠中促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠在低氧環(huán)境下抑制ADAM8的表達(dá)。

綜上所述，丙泊酚可能通過抑制ADAM8的表達(dá)拮抗低氧環(huán)境，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。