維生素D在子宮內(nèi)膜異位癥免疫發(fā)病機(jī)制中的作用研究

韋成厚 韓立薇 張婧 李艷秋 李玉華 聶華

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMT）是一種常見的婦科良性疾病，在育齡女性中發(fā)病率高達(dá)10%～15%[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，EMT 也是一種自身免疫性疾病，是由于免疫細(xì)胞平衡失調(diào)所致，關(guān)于EMT 免疫學(xué)方面的研究已成為近年來的研究熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)[3，4]，維生素D 具有調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥、調(diào)節(jié)血管生成等作用，參與了EMT 的發(fā)病過程，維生素D 參與調(diào)節(jié)體內(nèi)Th1/Th2/Th17/Treg 的平衡，對限制過度的炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定免疫耐受具有重要的調(diào)節(jié)作用。Th17 及Treg 細(xì)胞是兩種重要的CD4+效應(yīng)T 細(xì)胞，在介導(dǎo)EMT 信號通路發(fā)生的免疫應(yīng)答過程中均發(fā)揮重要作用[5]。本研究通過臨床病例對照分析，旨在探討維生素D 及Th17/Treg 失衡與EMT 免疫發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象采用病例對照研究法，選取2021年4～9月于我院婦科行腹腔鏡手術(shù)的患者，分為兩組。觀察組（EMT 患者）40 例，平均年齡（30.68±4.19）歲，對照組（輸卵管阻塞性不孕患者）40 例，平均年齡（30.08±4.58）歲。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：①育齡期女性，月經(jīng)規(guī)律，月經(jīng)周期26～35d；②術(shù)前3 個月未接受GnRH-a 或雌孕激素治療；③未合并子宮腺肌癥、子宮肌瘤；④無自身免疫性疾病病史；⑤術(shù)中所見且術(shù)后病理證實為（單側(cè)或雙側(cè)）卵巢型EMT。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①育齡期女性，月經(jīng)規(guī)律，月經(jīng)周期26～35d；②無痛經(jīng)史及月經(jīng)異常史；③輸卵管阻塞性不孕；④婦科B 超及婦科（宮）腹腔鏡檢術(shù)中所見均不提示子宮肌瘤、子宮腺肌癥及EMT；⑤無自身免疫性疾病史。所有入組患者均知情同意，手術(shù)時間均選擇在月經(jīng)干凈后3～7d 內(nèi)。本研究已經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，倫審研字[2020]（14）號。

1.2 檢測指標(biāo)檢測外周血維生素D 的人體內(nèi)主要儲存形式25（OH）D3濃度，外周血CD4+T 細(xì)胞亞群Th17、Treg 細(xì)胞濃度，Th17 細(xì)胞分泌的IL-17、IL-6 細(xì)胞因子濃度，Treg 細(xì)胞分泌的IL-10、TGF-β 細(xì)胞因子濃度。

1.3 標(biāo)本的收集及處理晨起抽取空腹外周靜脈血5ml，置于10ml 玻璃干燥促凝試管中，室溫放置30min 內(nèi)，然后以高速離心機(jī)3 000xg 離心30min，收集上清液存放于無菌的EP 管中，立刻在-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融循環(huán)。

1.4 主要儀器設(shè)備及試劑主要試劑盒：Human IL-17 ELISA kit（ab100556，Abcam，The UK）；Human IL-6 ELISA kit（ab178013）；Human IL-10 ELISA kit（ab46034）；Human TGF beta 1 ELISA kit （ab100647）；Human T helper cell 17（TH17） ELISA Kit （MB-4385A；MEIBIAO BIOLOGY，China），Human Regulatory T cells （Treg） ELISA Kit （MB-4243A）和25（OH）D3ELISA Kit （UNEB0049； Reagent Genie，German）。主要設(shè)備：酶標(biāo)儀（Synergy H1；BioTek；the USA），檢測波段：450nm。

1.5 檢測方法采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預(yù)先包被目標(biāo)因子/細(xì)胞檢測抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP 標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)因子/細(xì)胞濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）并計算樣品濃度，計量單位為ng/ml。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用獨立樣本t檢驗進(jìn)行組間比較，檢測指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)以r來表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者各檢測指標(biāo)的表達(dá)水平比較觀察組患者外周血25（OH）D3、Treg、IL-10、TGF-β 表達(dá)水平與對照組比較明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組Th17、IL-17、IL-6 表達(dá)水平與對照組比較明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者各檢測指標(biāo)的表達(dá)水平比較（±s，ng/ml）

表1 兩組患者各檢測指標(biāo)的表達(dá)水平比較（±s，ng/ml）

組別 例數(shù) 25（OH）D3 Th17 Treg IL-17 IL-6 IL-10 TGF-β觀察組 40 0.74±0.33 0.07±0.01 0.27±0.11 0.99±0.39 0.36±0.12 0.09±0.02 4.84±2.20對照組 40 0.94±0.43 0.05±0.01 0.34±0.08 0.70±0.20 0.29±0.04 0.12±0.01 6.30±3.31 t-2.287 6.539 -3.420 4.210 3.254 -6.039 -2.326 P 0.025 0.000 0.001 0.000 0.002 0.000 0.023

2.2 觀察組患者25（OH）D3和Th17、Treg 及其分泌的細(xì)胞因子表達(dá)水平的相關(guān)性分析觀察組患者外周血25（OH）D3與Th17、IL-17、IL-6 的表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.362、-0.514、-0.571，均P＜0.05），與Treg、IL-10、TGF-β 的表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r=0.683、0.433、0.314，均P＜0.05）。

2.3 對照組患者25（OH）D3和Th17、Treg 及其分泌的細(xì)胞因子表達(dá)水平的相關(guān)性分析對照組患者外周血25（OH）D3與Th17、IL-17、IL-6、IL-10的表達(dá)水平均無相關(guān)性（r=-0.227、-0.194、-0.005、-0.087，均P＞0.05），與Treg、TGF-β 的表達(dá)水平也無相關(guān)性（r=0.048、0.112，均P＞0.05）。

3 討論

EMT 的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，目前關(guān)于EMT發(fā)病機(jī)制的許多學(xué)說中，自身免疫性疾病假說得到了越來越多的理論支持[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7，8]，EMT 患者體內(nèi)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞活性增強(qiáng)及數(shù)量增多，IgG及抗子宮內(nèi)膜抗體明顯增加，免疫監(jiān)視功能、免疫殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒作用減弱而不能有效清除異位內(nèi)膜，所有這些證據(jù)都提示在EMT 發(fā)生和進(jìn)展的過程中出現(xiàn)了免疫系統(tǒng)的異常，尤其是CD4+T 淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞屬于CD4+T 淋巴細(xì)胞亞型，主要分泌IL-17、IL-6、IL-22、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，在機(jī)體對抗病原體和防御感染中發(fā)揮作用[9]。Treg 細(xì)胞屬于一種T 細(xì)胞亞群，主要通過分泌IL-10、IL-4 和TGF-β 等抗炎細(xì)胞因子對效應(yīng)T 細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，從而避免因為免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體損傷[10]。正常情況下機(jī)體處于免疫穩(wěn)態(tài)可由Th17 和Treg 細(xì)胞兩者相互拮抗，維持動態(tài)平衡來實現(xiàn)[11]。維生素D 屬于脂溶性維生素，無生物活性，機(jī)體可通過皮膚合成維生素D3，在肝內(nèi)維生素D3被25-羥化酶轉(zhuǎn)化成25（OH）D3，后者在1α-羥化酶作用下生成具有生物活性形式的1，25（OH）2D3[12，13]。血清25（OH）D3因其生物活性穩(wěn)定易于測定，目前是臨床上用作代表體內(nèi)活性維生素D 水平的最佳檢測指標(biāo)[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15，16]，維生素D 通過活性形式1，25（OH）2D3與VDR 發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后，可使T 淋巴細(xì)胞的增殖和分化功能受到抑制，從而打破機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致Th17/Treg 細(xì)胞平衡失調(diào)，誘發(fā)多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病。

本研究中，觀察組患者外周靜脈血25（OH）D3、Treg 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β 濃度明顯低于對照組（P＜0.05），而觀察組患者外周靜脈血Th17 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-6濃度明顯高于對照組（P＜0.05），此外，本研究進(jìn)一步表明，觀察組患者25（OH） D3與Th17、IL-17、IL-6 均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與Treg、IL-10、TGF-β均呈正相關(guān)（P＜0.05），而對照組患者25（OH）D3與Th17、Treg 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子間無相關(guān)性（P＞0.05），本研究結(jié)果佐證了相關(guān)文獻(xiàn)報道[17～20]。由此說明，EMT 患者相較于輸卵管因素不孕的非EMT 患者，因為外周血中25（OH）D3缺乏，可促進(jìn)Th17 細(xì)胞和其分泌的相關(guān)炎癥因子IL-17、IL-6 產(chǎn)生，同時，抑制Treg 細(xì)胞和其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β 產(chǎn)生，從而使Th17/Treg 平衡失調(diào)，發(fā)生Treg 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞飄移現(xiàn)象，當(dāng)占優(yōu)勢的Th17 細(xì)胞和其分泌的相關(guān)炎癥因子過度表達(dá)后，機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)而免疫抑制作用及有效清除異位內(nèi)膜能力減弱，出現(xiàn)病理損傷，促進(jìn)了EMT 發(fā)生。

綜上所述，維生素D 可能影響EMT 患者Th17/Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，維生素D 與Th17/Treg 細(xì)胞失衡二者間存在負(fù)相關(guān)，維生素D 可能通過調(diào)節(jié)EMT 患者外周血Th17/Treg 免疫平衡系統(tǒng)，參與EMT 的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于維生素D 和Th17/Treg 細(xì)胞在EMT 患者腹腔液、在位及異位內(nèi)膜中的表達(dá)及相關(guān)情況，我們后期將進(jìn)行更深入研究，從而進(jìn)一步探明EMT 的發(fā)病機(jī)制，為EMT 預(yù)防和靶向治療提供一定的理論依據(jù)和新思路。