恩替諾特通過調控miR-103a-3p/PIEZO1通路抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖遷移侵襲的機制研究

李 鵬

(首都醫科大學附屬北京口腔醫院， 北京 100050)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是一種侵襲、轉移能力較強的惡性腫瘤[1]。該病在診斷、治療方面取得了一定進展，但是由于晚期治療預后差、復發率高的問題，患者的存活時間仍令人不滿意。臨床上仍缺乏有效的精準高效治療藥物。恩替諾特是一種基于氨基苯甲酰胺的組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑[2,3]，其在乳腺癌中的抗增殖、促凋亡作用得到體內外研究的證實[4]。恩替諾特在OSCC中的抗癌功效得到初步發展[5]，但是其發揮作用的分子機制仍需繼續探索。微小RNA(miRNA)是一種保守的內源單鏈18～25個核苷酸的非編碼小分子，可影響靶基因的轉錄、翻譯，調節蛋白表達，進而參與人類疾病的發展過程[6]。miR-103a-3p在多種癌癥中失調，參與癌癥的惡化或治療進展，其中包括OSCC[7,8]。但是其是否與恩替諾特的抗OSCC有關仍未可知。機械敏感離子通道蛋白(Mechanosensitive ion channel protein，PIEZO1)能夠通過多種機制發揮致癌作用[9]。本研究擬以OSCC細胞WSU-HN6為研究對象，觀察恩替諾特、miR-103a-3p、PIEZO1對WSU-HN6細胞增殖、遷移侵襲的影響，揭示恩替諾特的抗癌作用與miR-103a-3p、PIEZO1之間的聯系。

1 材料與方法

1.1材料:恩替諾特(批號：209783-80-2；純度≥99%)來自南京恩德薩生物科技有限公司；口腔鱗狀細胞癌細胞WSU-HN6(CVCL_5516)來自美國菌種保藏中心；胎牛血清來自杭州仟諾生物公司；DMEM培養液來自浙江GENOM；脂質體2000轉染試劑來自美國Invitrogen；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒來自日本TAKARA；細胞計數試劑盒(CCK8)來自日本同仁；Transwell小室來自美國Corning；兔抗E-cadherin、N-cadherin、PIEZO1多抗、HRP標記的二抗均來自上海艾博抗；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒來自上海碧云天研究所。

1.2方 法

1.2.1細胞培養:WSU-HN6細胞使用10%胎牛血清+1%青鏈霉素的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2的飽和濕度空氣的恒溫細胞培養箱中培養。隔天更換一次細胞培養液。

1.2.2細胞轉染:細胞培養液將恩替諾特調至0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μmoL/L，與WSU-HN6細胞分別共培養24、48、72h。篩選2.0μmoL/L處理48h的WSU-HN6細胞為最適細胞。3-5倍質量的脂質體試劑將antagomiRNA、antagomiR-103a-3p、pcDNA、pcDNA-PIEZO1、2.0μmoL/L+antagomiRNA、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1轉染WSU-HN6細胞，設為antagomiRNA組、antagomiR-103a-3p組、pcDNA組、pcDNA-PIEZO1組、2.0μmoL/L+antagomiRNA組、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p組、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC組、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1組，轉染8h后，更換新培養基繼續培養至48h，用RT-qPCR或WB實驗檢測轉染的效果。

1.2.3CCK8實驗檢測細胞增殖:收集各組培養48h的細胞，按照CCK8試劑盒要求處理細胞，調整細胞濃度。1000個細胞/孔接種96孔板，每孔10μL的CCK8反應液，微微震蕩，混勻，避光孵育25min。490nm波長下檢測細胞的吸光度(OD490)。細胞增殖率(%)=(OD490實驗組-OD490對照組)/OD490對照組×100%。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞遷移侵襲:收集各組培養48h的細胞，更換為無任何營養因子、血清的培養基，饑餓處理24h，待用。準備含有基質膠的小室和不含基質膠的小室，37℃預熱。用基質膠模擬人體的細胞外基質，檢測細胞破壞基質發生侵襲的能力。用不含基質膠的小室檢測細胞的遷移能力。將細胞調至0.5×104個/mL，取200μL鋪勻在上室，取600μL含有營養因子和血清的培養基置下室，37℃培養箱常規培養12h。小心取出小室，上室下膜朝上，浸入4%對聚甲醛固定，結晶紫染色。顯微鏡下計數，拍照。采用五點法計數，取平均值。

1.2.5WB實驗檢測細胞E-cadherin、N-cadherin、PIEZO1蛋白:收集各組培養48h的細胞，裂解液充分裂解，提取總蛋白并定量，變性。用變性后的上清做蛋白電泳上樣模板，行SDS-PAGE電泳。結束后，用轉膜儀將蛋白從膠轉移至PVDF膜。2.5%脫脂奶粉封閉液37℃封閉2h。逐滴加入一抗(兔抗E-cadherin多抗，1∶1000；兔抗N-cadherin多抗，1∶1500；兔抗PIEZO1多抗，1∶1000)，約10mL，4℃孵育過夜。PBS洗膜，再滴加二抗(HRP標記的二抗，1∶500)，浸沒膜，37℃孵育1.5h。ECL發光液顯影，曝光。用Image J分析蛋白條帶的灰度值，目的灰度值/內參灰度值表示蛋白相對表達量。

1.2.6RT-qPCR實驗檢測細胞miR-103a-3p、PIEZO1:收集各組培養48h的細胞，用RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒提取總RNA并合成cDNA，-20℃保存。打開RT-qPCR試劑盒，嚴格按照說明書要求操作，檢測樣本中miR-103a-3p、PIEZO1的表達情況。U6、GAPDH為內參，2-△△Ct法計算。所用引物：miR-103a-3p，正向引物5′-GCGAGCAGCATTGTACAGG-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；PIEZO1正向引物5′-GGACTCTCGCTGGTCTACCT-3′，反向引物5′-GGGCACAATATGCAG GCAGA-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGT CCGAGGTATTC-3′;GAPDH正向引物5′-GACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，反向引物5′-AG GAGTGGGTG TCGCTGT-3′。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-103a-3p與PIEZO1的結合力:靶基因在線預測網站Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、targetscan(https://www.targetscan.org/)預測miR-103a-3p的靶基因，發現PIEZO1為其下游靶點之一。根據互補的結合位點序列合成PIEZO1 3′UTR-WT片段(含有互補的結合位點的野生序列)和PIEZO1 3′UTR-MUT片段(不含有互補的結合位點的突變序列)，并插入熒光載體，構建銀光報告基因。將構建的熒光基因與agomiRNA、agomiR-103a-3p、antagomiRNA、antagomiR-103a-3p共轉染至WSU-HN6。恢復室溫的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，按照操作手冊要求操作，檢測細胞的熒光活性。用細胞的相對熒光活性強度表示miR-103a-3p與PIEZO1的結合能力的強弱。

2 結 果

2.1恩替諾特對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖的影響:結果如圖1所示，24、48、72h的2.0、4.0μmoL/L恩替諾特處理WSU-HN6細胞的增殖率顯著低于1.0μmoL/L恩替諾特處理的WSU-HN6細胞，多因素重復測量方差分析呈時間濃度依賴性(F總=19.45，F時間=180.100，F處理=69.530，P<0.05)。2.0μmoL/L濃度處理的WSU-HN6細胞的增殖率的降低幅度最大，故選用該濃度用于后續研究。

圖1 不同濃度恩替諾特處理的WSU-HN6細胞的增殖率

2.2恩替諾特對口腔鱗狀細胞癌細胞遷移侵襲的影響:結果如圖2和表1所示，與0.0μmoL/L組相比，2.0μmoL/L組細胞遷移、侵襲數量均顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高，N-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

表1 恩替諾特處理的WSU-HN6的細胞遷移侵襲及相關蛋白表達

圖2 E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達

2.3恩替諾特調控口腔鱗狀細胞癌細胞miR-103a-3p、PIEZO1表達:結果如圖3和表2所示，與0.0μmoL/L組相比，2.0μmoL/L組細胞miR-103a-3p表達顯著升高，PIEZO1的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

表2 恩替諾特處理的WSU-HN6細胞miR-103a-3p PIEZO1的表達

圖3 IEZO1蛋白表達

2.4抑制miR-103a-3p調控口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移侵襲:結果如圖4和表3所示，與antagomiRNA組相比，antagomiR-103a-3p組細胞miR-103a-3p表達顯著降低，細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量均顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低，N-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)。

圖4 E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

表3 抑制miR-103a-3p的WSU-HN6細胞增殖遷移侵襲情況

2.5過表達PIEZO1調控口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移侵襲:結果如圖5和表4所示，與pcDNA組相比，pcDNA-PIEZO1組細胞PIEZO1的mRNA和蛋白表達均顯著升高，細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量均顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低，N-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)。

表4 過表達PIEZO1的WSU-HN6細胞增殖遷移侵襲情況

圖5 PIEZO1、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達

2.6miR-103a-3p靶向PIEZO1:Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、targetscan(https://www.targetscan.org/)預測到miR-103a-3p與PIEZO1之間的互補結合位點，如圖6A。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-103a-3p可抑制野生型PIEZO1細胞的熒光活性，而對其它細胞的熒光活性無顯著影響，如圖6B。與agomiRNA組相比，agomiR-103a-3p組細胞PIEZO1的mRNA和蛋白表達均顯著降低，與antagomiRNA組相比，antagomiR-103a-3p組細胞PIEZO1的mRNA和蛋白表達均顯著升高，如圖6C、D、E。

圖6 miR-103a-3p靶向調控PIEZO1

2.7敲減PIEZO1逆轉抑制miR-103a-3p、恩替諾特對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移侵襲的影響:結果如圖7和表5所示，與2.0μmoL/L+antagomiRNA組相比，2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p組細胞miR-103a-3p表達顯著降低，細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量均顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低，N-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC組相比，2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1組細胞miR-103a-3p表達顯著升高，細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量均顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高，N-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

表5 抑制PIEZO1和miR-103a-3p的WSU-HN6細胞增殖遷移侵襲情況

圖7 E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達

3 討 論

恩替諾特能夠逆轉食管鱗癌的順鉑耐藥、調節口腔鱗癌細胞的增殖和細胞周期的功能[10]，但是其在口腔鱗狀細胞癌細胞的表型調控中的作用仍為十分清楚。Marques及其團隊[11]的最新研究報道，恩替諾特可抑制口腔鱗癌細胞增殖，細胞周期阻滯G0/G1期，誘導癌細胞凋亡，活性氧大量增加，組蛋白H3和組蛋白H4乙酰化增加，揭示恩替諾特的抗癌價值。本研究發現，恩替諾特能夠以濃度依賴性抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖，并抑制癌細胞的遷移和侵襲，促進E-cadherin表達，抑制N-cadherin表達，本實驗結果再次確定了恩替諾特對口腔鱗狀細胞癌細胞表型的惡化抑制作用。令人遺憾的是，恩替諾特在口腔鱗狀細胞癌中發揮抗癌作用的機制尚未十分清楚。進一步研究發現，恩替諾特明顯的上調癌細胞中miR-103a-3p的水平，且抑制PIEZO1的表達，也許miR-103a-3p、PIEZO1與恩替諾特的抗癌作用存在一定的聯系。

有研究報道，miR-103a-3p在口腔鱗狀細胞癌患者中高表達，且與患者的不良預后緊密相關，抑制miR-103a-3p后，口腔鱗狀細胞癌細胞增殖得到控制，凋亡能力得到增強，并且還抑制異種移植裸鼠腫瘤的生長[12]。Liu等[13]在舌鱗狀細胞癌研究中發現，miR-103a-2-5p與LncRNA LTSCCAT直接存在直接靶向關系，參與上調的LTSCCAT的促進癌細胞遷移侵襲作用，這暗示miR-103a-2-5p參與舌鱗狀細胞癌細胞的遷移侵襲作用。本研究發現，miR-103a-3p在口腔鱗狀細胞癌細胞中被恩替諾特的上調，并且抑制miR-103a-3p能夠明顯的增強了癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且還明顯的削弱了恩替諾特對癌細胞的增殖遷移侵襲抑制作用。這些實驗結果證實了miR-103a-3p在口腔鱗狀細胞癌中發揮抑癌基因的功能，這與Liu[13]在舌鱗癌中的研究結果相吻合，支持miR-103a-3p的抑癌功能。與Zhang[12]在口腔鱗癌中的研究結果相悖，認為miR-103a-3p可能不具有致癌的潛力。miRNA在癌癥中的調控網絡十分復雜，相關的上下游作用機制相互交叉，同一個miRNA在癌癥的不同通路中的功能是不同的。本研究在體外細胞中驗證了miR-103a-3p的抑癌作用，后續將在至少3株癌細胞及裸鼠體內為此結果提供更有說服力的理論支持。深入研究還發現，miR-103a-3p可靶向負調控PIEZO1的表達，于是推測PIEZO1可能與miR-103a-3p在口腔鱗狀細胞癌中的功能有關。

PIEZO1是一種保守的多功能蛋白，在惡性腫瘤中作為致癌基因發揮著重要作用，在人類癌癥的診斷、預后中具有巨大潛在價值。Hasegawa等[14]發現，PIEZO1以YES相關蛋白(YAP)信號通路的靶點，有利于口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖，上調在癌組織中的表達。本研究發現，PIEZO1的表達水平能夠被恩替諾特抑制，并且過表達PIEZO1促進了口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制E-cadherin，促進N-cadherin，這驗證了PIEZO1在口腔鱗狀細胞癌中的致癌作用，與Hasegawa的實驗結果相一致。這個實驗結果暗示，PIEZO1作為miR-103a-3p下游靶標之一，確實可能參與miR-103a-3p的抗癌作用。進一步研究發現，敲減PIEZO1能夠增強恩替諾特的藥效，減弱下調miR-103a-3p對癌細胞增殖、遷移侵襲的促進作用。

綜上所述，恩替諾特抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲，產生這種作用的機制與miR-103a-3p/PIEZO1通路有關，為恩替諾特用于口腔鱗狀細胞癌的治療提供實驗支持。