黃芩苷對復發性口腔潰瘍模型大鼠IL-33/ST2信號通路的影響及機制研究

魏雅楠， 劉曉慧， 馬遠新

(河北省滄州中西醫結合醫院， 河北 滄州 061000)

復發性口腔潰瘍(Recurrent oral ulcer，ROU)是常見的口腔疾病，其發病率高，多見于女性[1]。臨床上，該病的主要癥狀是唇、舌、軟腭等黏膜部位反復出現潰瘍，表現為圓形或者橢圓形，通常伴有局部的紅腫和灼痛[2]。目前，該病的誘因以及發病機制還不完全清楚。ROU的臨床治療通常是采用西藥進行消炎、止痛并促進潰瘍部位愈合，但效果并不顯著，而傳統的中草藥對ROU有較好的治療作用[3]。黃芩苷主要取自黃芩的干燥根部，是一種黃酮類生物活性物質，具有抗炎、殺菌、鎮痛之療效[4]。既往研究[5]表明甘草瀉心湯對ROU的治療效果明顯，且復發率低。黃芩苷是甘草瀉心湯的主要成分之一，因此本研究推測單獨黃芩苷治療可能對ROU有同樣的作用。相關文獻[6]顯示黃芩苷通過抑制白細胞介素-33/腫瘤發生抑制蛋白2(Interleukin-33/suppression of tumorigenicity 2，IL-33/ST2)信號通路影響炎癥因子表達，進而改善過敏性鼻炎。但黃芩苷能否通過調控該通路影響ROU進展未見報道。因此，本研究通過黃芩苷干預觀察其對ROU模型大鼠的療效及其與IL-33/ST2信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物:8周齡健康雄性清潔級Sprague Dawley大鼠，體重200～220g，均購于北京實驗動物研究中心有限公司，SYXK(京)2021-0045為其動物許可證號。所有大鼠自由進食、喝水，均飼養在恒溫恒濕、12h光照、12h黑暗的環境下。

1.2藥物、試劑與儀器:弗氏完全佐劑(CFA)購自江蘇科惟生物技術有限公司；黃芩苷(純度≥98%)購自成都儀睿生物科技有限公司；左旋咪唑(純度≥99%)購自上海源葉生物科技有限公司；T淋巴細胞亞群檢測試劑盒購自北京同生時代生物技術有限公司；干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素(interleukin，IL)-17、IL-2、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯免疫吸附試劑盒購自江蘇生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒購自南京建成生物研究所；IL-33、ST2、核因子kB(Nuclear factor-kB，NF-kB)單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Abcam公司。組織勻漿機購自上海凈信實業發展有限公司；酶標儀購自美國伯樂公司；垂直電泳儀購自常州德杜精密儀器有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3實驗分組、造模及給藥方法:按照隨機數字表法將60只大鼠分成正常組，模型組，低、中、高劑量黃芩苷組和左旋咪唑組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均按照Xie L等[7]的方法進行ROU造模：大鼠麻醉后在口腔黏膜下注入生理鹽水，剝離黏膜并制備成組織勻漿，將其與CFA按照1∶1比例混合均勻。造模前1d將各組大鼠的兩側脊柱進行脫毛，造模時將0.2mL的抗原乳化液皮下注射至脊柱左右區域，每周一次，持續8周，正常組僅注射CFA。模型構建成功后，低、中、高劑量黃芩苷組大鼠分別灌胃25、50、100mg/kg黃芩苷，左旋咪唑組大鼠灌胃17.5mg/kg左旋咪唑[8]，正常組和模型組大鼠每天灌胃等量的生理鹽水，每天1次，持續20d。

1.4大鼠潰瘍癥狀的觀察和記錄:給藥結束后，肉眼觀察并記錄各組大鼠口腔潰瘍癥狀，包括潰瘍數目、持續時間、間隔時間。

1.5大鼠外周血T淋巴細胞亞群含量的測定:取100μL EDTA抗凝處理后的大鼠外周血，將其放入流式管底部，分別加入20μL APC-CD3、PE-CD4、FITC-CD8抗體，混合均勻，20min后在加入2mL溶血素，繼續混勻，靜置10min，離心、棄去上清液，并用PBS對細胞進行重懸，最后使用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+水平，并計算CD4+/CD8+比值。

1.6大鼠血清細胞因子水平的測定:各組大鼠給藥結束后，將其麻醉，經腹主動脈取血10mL，放在不含抗凝劑的試管中，靜置30min后，離心，取上清液，一部分依據酶聯免疫吸附試劑盒方法檢測IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α水平。

1.7大鼠血清氧化應激標志物含量的測定:取1.6中剩余血清，檢測其GSH、SOD、MDA含量，具體操作方法嚴格根據對應試劑盒說明書進行。

1.8大鼠口腔黏膜組織中IL-33/ST2信號通路相關因子蛋白水平的檢測:將各組大鼠安樂死后，取其口腔黏膜組織，將其研磨成勻漿，提取總蛋白，定量后上SDS-PAGE凝膠電泳儀分離蛋白，并將其轉至PVDF膜上，封閉后加入IL-33、ST2、NF-kB一抗，次日加入二抗，孵育結束后進行顯影，并以β-actin為內參，分析不同蛋白表達水平。

2 結 果

2.1黃芩苷對ROU大鼠潰瘍狀況的影響:與正常組相比，模型組大鼠潰瘍數目增多，持續時間顯著增加，間隔時間顯著延長(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量黃芩苷組大鼠潰瘍數目和持續時間明顯減少，間隔時間明顯延長(P<0.05)，表現為劑量依賴性，而左旋咪唑組與高劑量黃芩苷組間大鼠潰瘍數目、持續時間和間隔時間無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 黃芩苷對ROU大鼠潰瘍狀況的影響

2.2黃芩苷對ROU大鼠外周血T淋巴細胞亞群含量的影響:與正常組比較，模型組CD4+含量及CD4+/CD8+降低，CD8+含量升高(P<0.05)，且差異均有統計學意義；與模型組比較，低、中、高劑量黃芩苷組CD4+含量及CD4+/CD8+顯著增加，CD8+含量顯著減少(P<0.05)，而低劑量黃芩苷組CD8+變化較小，沒有顯著差異(P>0.05)；與高劑量黃芩苷組相比，左旋咪唑組上述指標均無明顯改變(P>0.05)，見表2。

表2 黃芩苷對ROU大鼠外周血T淋巴細胞亞群含量的影響

2.3黃芩苷對ROU大鼠血清細胞因子的影響:模型組大鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量明顯多于正常組(P<0.05)；低、中、高劑量黃芩苷組大鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量依次低于模型組(P<0.05)，而左旋咪唑組IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量與高劑量黃芩苷組的差異不具有統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 黃芩苷對ROU大鼠血清細胞因子的影響

2.4黃芩苷對ROU大鼠血清氧化應激水平的影響:與正常組相比，模型組GSH、SOD含量明顯下降，MDA含量明顯上升(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量黃芩苷組GSH、SOD含量顯著增加，MDA含量顯著減少(P<0.05)，呈劑量依賴性；而與高劑量黃芩苷組相比，左旋咪唑組GSH、SOD升高不顯著、MDA下降不顯著(P>0.05)，見表4。

表4 黃芩苷對ROU大鼠血清氧化應激水平的影響

2.5黃芩苷對ROU大鼠口腔黏膜組織中IL-33/ST2信號通路相關蛋白表達的影響:與正常組相比，模型組大鼠口腔黏膜組織中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達顯著上調(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量黃芩苷組大鼠口腔黏膜組織中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達顯著下調(P<0.05)，且低劑量黃芩苷組>中劑量黃芩苷組>高劑量黃芩苷組；而左旋咪唑組與高劑量黃芩苷組IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達沒有明顯差異(P>0.05)。見圖1、表5。

表5 黃芩苷對ROU大鼠口腔黏膜組織中IL-33/ST2信號通路相關蛋白表達的影響

圖1 各組大鼠口腔黏膜組織中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達水平

3 討 論

食物、心情、激素、口腔的局部創傷及菌群失調均能誘發ROU。該病一旦發作就疼痛難忍，且容易反復，不僅影響飲食，還妨礙語言、情緒，對人們的生活、工作產生非常不利的影響。中醫學將ROU歸類到“口瘡”范疇，認為ROU的病癥雖在口腔中，但其發生發展與人們的五臟六腑聯系密切。近年來發現，中草藥在ROU的治療方面有著不可替代的作用[3]。黃芩苷是從中藥黃芩根中提取的生物活性物質，其功能多樣，例如抗癌[9]、抗炎[4]等。以往研究[5]發現甘草瀉心湯可減輕ROU患者口腔炎癥反應，有助于其黏膜的修復，在預防病情反復發生效果顯著。黃芩苷作為甘草瀉心湯的主要成分之一，可能對ROU有類似的治療效果。因此，本研究通過建立ROU大鼠模型，觀察黃芩苷對ROU的治療效果并探討其作用機制。

相關研究[7]表明ROU的發生與自身免疫失調有關，CD4+和CD8+是T淋巴細胞的兩個亞群，二者作用相反，互相制衡和調節，是檢測機體免疫反應水平的重要指標，CD4+/CD8+比值的降低可使口腔黏膜發生局部潰瘍。本研究結果顯示，模型組大鼠潰瘍數目和持續時間明顯增加，間隔時間明顯延長，CD4+含量及CD4+/CD8+降低，CD8+含量升高，與曲宸等[10]和Xie L等[7]的研究結果一致，說明ROU大鼠模型構建成功，也進一步揭示ROU的發生與細胞免疫有關。經黃芩苷治療后，ROU大鼠的潰瘍病癥明顯改善，CD4+含量及CD4+/CD8+顯著增加，揭示黃芩苷通過調節T淋巴細胞亞群失衡對ROU大鼠有明顯的治療作用。

血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α等細胞因子的異常表達是導致ROU發生的主要因素之一，IFN-γ是Th1細胞分泌的細胞因子，其水平與潰瘍病情的嚴重程度呈正比[11]。IL-17是一種促炎因子，由活化的T細胞分泌而來，能夠刺激上皮細胞炎癥因子的釋放，進而導致機體炎癥的發生[12]。TNF-α的增多會誘導IL-2等炎癥因子的產生，致使炎性細胞浸潤增加，從而加重潰瘍程度[13]。本研究發現，黃芩苷可下調炎癥因子水平，說明黃芩苷可通過調節T淋巴細胞亞群失衡影響炎癥因子的水平，進而改善ROU大鼠的炎癥反應。

炎癥反應的加劇導致大量自由基產生，進而使機體發生氧化應激損傷。而抗氧化能力的下降也是ROU發生的原因之一，GSH、SOD和MDA是檢測機體氧化應激水平的標志物。有文獻[14]顯示，在口腔潰瘍發生時，GSH、SOD含量升高，MDA含量下降。本研究結果顯示，黃芩苷可通過提高GSH、SOD含量、降低MDA含量降低ROU大鼠的氧化損傷，進而對ROU起治療作用。

上述研究均表明黃芩苷通過降低炎癥反應和氧化損傷對ROU產生治療作用，但是其具體機制還不清楚。IL-33通過與ST2和輔助受體IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)組成的異二聚體受體結合，進而在靶細胞上發揮作用。有文獻[15]顯示茯苓多糖通過抑制IL-33、ST2蛋白表達減輕潰瘍性結腸炎的浸潤程度。也有研究[6]表明在過敏性鼻炎模型大鼠中，IL-33、ST2、NF-kB mRNA表達顯著上調。與上述研究一致，ROU大鼠口腔黏膜組織IL-33、ST2、NF-kB蛋白表達顯著提高，而黃芩苷處理后上述蛋白水平均明顯下調，表明黃芩苷可能通過抑制IL-33/ST2通路調節炎癥因子及氧化應激標志物水平改善炎癥和氧化損傷，進而對ROU模型大鼠發揮治療作用。

綜上所述，黃芩苷對ROU模型大鼠具有明顯的治療作用，其機制可能是抑制IL-33/ST2通路的激活，降低炎癥反應、氧化損傷以及調控T淋巴細胞亞群，進而加快口腔黏膜的修復，為ROU的臨床治療提供新的靶向藥物，但是其遠期療效還需進一步研究。