OPN TIMP-2及STAT3蛋白在子宮內膜異位癥患者中的表達及臨床意義

陳觀盛， 鄭 蓉

(北京積水潭醫院婦產科， 北京 100035)

子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMS)是指子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位發生具有生長功能的子宮內膜組織，屬于具有惡性生物學行為的良性婦科疾病。在臨床中發現，EMS患者異位內膜的黏附、侵襲、血管生成、細胞無限增殖生物學行為均與惡性腫瘤相似[1]。雖然屬于良性疾病，但仍會對患者造成較大心理壓力，對患者生活也可造成一定影響，早期診斷是治療與預防EMS發生的關鍵。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)為分泌性的磷酸化糖蛋白，在大腸癌、卵巢上皮性癌、肝癌等惡性腫瘤中均為高表達，且與腫瘤黏附、轉移、凋亡之間關系密切[2]。基質金屬蛋白酶組織抑制因子2(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP-2)是組織抑制因子中的一員，具有抑制基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)的作用，可調控細胞外基質中MMP的降解，在惡性腫瘤的侵襲過程中發揮著重要的作用[3]。在以往多數研究中發現，多種腫瘤中存在信號轉導和轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)過度活化現象，EMS病灶形成與腫瘤轉移之間非常相似，因此認為STAT3激活與EMS組織遷徙與侵入可能存在聯系[4,5]。基于此，本文旨在分析OPN、TIMP-2及 STAT3蛋白在子宮內膜異位癥患者中的表達情況，了解其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月至2020年1月在本院收治的117例子宮內膜異位癥患者臨床資料(EMS組)，患者年齡26～60歲，平均(38.77±5.16)歲，根據美國生育協會評分標準(r-AFS)分期[6]，Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期64例；月經周期：增生期66例，分泌期51例。納入標準：①均經術后病理檢查確證(病理檢查可見異位內膜伴有周圍纖維組織增生和粘連形成，有大小不等的紫藍色結節或包塊。切開結節或包塊可看到陳舊性出血和瘢痕。鏡下檢查可見子宮內膜的腺體及間質。)；②符合EMS疾病診斷標準[6]：患者有疼痛(非經期下腹痛、痛經、深部性交痛等)、不孕、月經失調等癥狀；超聲檢查可見子宮的后方或側方包塊，包膜粗糙，內為密集細小強光點反射或不規則反射，彩超包塊內無血流；腹腔鏡檢查下可見病灶。③臨床資料完整；④自愿加入本次研究，家屬及患者均簽署知情同意書。排除標準：①存在感染性疾病或自身免疫性疾病；②合并惡性腫瘤者；③在入院前3個月內有進行內分泌激素治療者；④存在其他婦科感染性疾病或炎性疾病者。另選取同期收治子宮肌瘤或不孕癥行手術治療的非EMS者103例，年齡26～61歲，平均(39.56±5.37)歲。兩組一般資料比較并無差異，具有可比性(P>0.05)。見表1。

表1 一般資料比較

1.2OPN、TIMP-2及STAT3檢測方法：使用免疫印跡實驗檢測TIMP-2及STAT3蛋白含量，所有患者均在術中獲取子宮內膜組織100mg，提取蛋白后進行下一步檢測，按照配方配置濃縮膠(4%)、分離膠(10%)，將樣本加入到點樣孔中，垂直進行電泳和電轉膜。使用脫脂牛奶(5%)封閉，在2h后根據抗體說明書進行蛋白分子量預測，進行NC膜裁剪，孵育OPN、TIMP-2及STAT3第一抗體。在第2天將NC膜取出，使用TBST洗滌液洗滌3遍后加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2h，再次使用TBST洗滌液洗滌3次進行顯影處理，隨后使用相應軟件對蛋白條帶灰度值進行分析，根據基因灰度值/內參actin灰度值作為蛋白含量，令對照組蛋白含量為100，計算蛋白含量。OPN使用酶聯免疫法進行檢測，在患者入院后抽取靜脈血液4mL，使用離心機離心5min(速度3000r/min，半徑10cm)試劑為武漢博士德股份有限公司提供。使用酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號：Synergy H1)檢測450nm處的吸光度(OD值)，并繪制標準曲線，計算出相應的濃度，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1不同人群中OPN、TIMP-2及STAT3表達情況比較：EMS組OPN、STAT3表達明顯高于對照組，TIMP-2水平則明顯低于對照組，差異存在統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同人群中OPN TIMP-2及 STAT3表達情況比較

2.2不同分期患者OPN、TIMP-2及STAT3表達情況比較：Ⅲ～Ⅳ期OPN、STAT3表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，TIMP-2水平則明顯低于Ⅰ～Ⅱ期，差異存在統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同分期患者OPN TIMP-2及STAT3表達情況比較

2.3不同月經周期患者OPN、TIMP-2及STAT3表達情況比較：增生期OPN、STAT3表達明顯高于分泌期，TIMP-2水平則明顯低于分泌期，差異存在統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同月經周期患者OPN TIMP-2及STAT3表達情況比較

2.4OPN、TIMP-2及STAT3與r-AFS分期相關性：EMS患者血清OPN、STAT3值與患者r-AFS分期為正相關，TIMP-2與r-AFS分期為負相關，相關關系存在統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 OPN TIMP-2及STAT3與r-AFS分期相關性

3 討 論

OPN作為一種分泌型酸性蛋白和細胞的遷移、分化之間密切相關。OPN可通過與某些分子相結合發揮激活一系列細胞信號，促進細胞不斷增生，從而導致腫瘤發生；通過與整合素dvB3結合可引起多種蛋白溶解酶合成且分泌到細胞外，進而溶解細胞外基質屏[7]。有研究發現，OPN可能與EMS發生存在密切的聯系，在EMS中表達明顯升高，與其可促進細胞黏附、浸潤以及血管生成等有關[8]。在本研究中OPN在EMS中表達明顯高于對照組，且隨著分期增加其表達也明顯上升，提示OPN可能參與EMS發生、發展過程。在以往研究中有學者通過檢測OPN在EMS患者異位組織中的表達情況發現，OPN呈高表達，認為OPN和EMS形成之間存在密切的聯系[9]。而本研究也表明OPN與EMS患者r-AFS分期呈正相關，結合以往研究分析，可能與OPN可改變細胞骨架促進細胞黏附與游走有關[10]。此外在患者增生期時OPN表達比分泌期高，說明在增生期更有助于EMS患者子宮內膜異位種植和轉移。

TIMP-2主要在EMS患者的血管內皮細胞、腺上皮細胞中分布，在間質細胞中表達較低。在以往研究中顯示，基底膜的完整性是判斷異位內膜浸潤與侵襲的重要標志，TIMP-2在這一過程的調節中具有特殊的意義，可控制細胞外基質的降解合成[11]。在本研究中發現，TIMP-2在EMS患者中表達明顯低于對照組，且隨著患者病情發展r-AFS分期升高其表達為逐漸降低的趨勢，與r-AFS分期呈負相關，在增生期時TIMP-2值明顯降低。在以往研究中也發現，在EMS患者異位組織中TIMP-2表達明顯降低，而MMPs表達明顯增高，兩者之間表達失衡，TIMP-2對MMP的作用降低，導致異位內膜中的MMPs水解蛋白活性增加，異位的侵襲與種植能力就會增加，進而導致EMS發生[12]。也有動物研究發現，將人子宮內膜立即注入裸鼠腹腔內，子宮內膜仍可分泌出MMPs，并可在腹腔內種植，但在注射TIMPs后MMPs分泌被抑制，阻礙了異位病灶的發生[13]。以上研究結果說明TIMP-2在患者異位組織中表達降低，無法抑制MMPs，從而促進ESM發展。

STAT3在機體多種細胞及組織中均有表達，磷酸化后可被激活從而進入到細胞核中，并通過與起動因子區域結合來調控靶基因的表達，從而來參與到細胞的生物學行為中。臨床中發現STAT3信號通路與細胞分化、增殖及侵襲之間密切相關。在本研究中EMS患者中STAT3表達明顯高于對照組，且隨著患者分期增加，其表達也明顯增加，提示EMS患者中存在STAT3過度活化現象。在以往研究中發現，EMS患者腹腔積液中存在大量促炎性因子，這是激活JAK/STAT3通路的重要刺激因子，也可能是導致EMS患者STAT3過度活化的原因之一[14]。同時也有研究顯示，STAT3過度活化可參與子宮內膜的蛻膜化，在女性受孕過程中具有重要的作用[15]。在本研究中患者STAT3在增生期水平高于分泌期，說明STAT3活化異常可能與子宮內膜蛻膜化分化功能異常有關。

綜上所述，在EMS患者中OPN、STAT3表達增加、TIMP-2表達下調，三者與患者發生與病情進展間關系密切，監測三者表達情況可為疾病發展預測及轉歸提供參考。