一株野生花臉香蘑的鑒定及其液體培養(yǎng)基的篩選*

崔 曉，叢倩倩，王慶武，蘭玉菲，陳萬杰

（1．泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山東 泰安 271000；2．冠縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 冠縣 252500）

花臉香蘑（Lepista sordida） 又稱紫晶蘑、紫花臉等[1]，屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 香蘑屬（Lepista）[2]，主要分布于我國東北地區(qū)及河北、山東、四川、云南、貴州等地。子實體顏色鮮艷，氣味濃香，味道鮮美。花臉香蘑營養(yǎng)價值較高，其子實體干品中含粗蛋白43．03%、多糖10．31%、粗纖維 7．6%、脂肪 2．01%，氨基酸種類齊全，符合FAO/WHO優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的要求，還含有鈣、鐵、鋅等人體必需的微量元素及維生素[3-5]。不僅是餐桌佳品，還兼具防癌、抗腫瘤[6]等功效，是一種珍稀優(yōu)良的食用菌，極具市場開發(fā)潛力[7-9]。

菌種是食用菌產(chǎn)業(yè)的最基本要素，液體菌種在生產(chǎn)上有生長快、活力強、接種方便等優(yōu)點[10-11]，有助于縮短制種周期、提高菌類的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來常作為配套技術(shù)應(yīng)用于金針菇（Flammulina velutipes）、香菇（Lentinula edodes） 等菌類的工廠化生產(chǎn)中。相對于平菇（Pleurotus ostreatus）、黑木耳（Auricularia auricula）等大宗菌類，香蘑屬菌株的菌絲生長較慢、長勢弱，液體菌種在提高其制種水平上將有很大應(yīng)用潛力。

通過對分離自泰山山脈的1株野生菌株進(jìn)行分類鑒定，并初步篩選出適合其生長的液體培養(yǎng)基，旨在為下一步馴化選育和綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1．1．1 供試菌株

供試子實體于2016年采集于山東省泰山山脈（36°16′13″N，117°04′07″E，海拔 581 m），通過組織分離獲得純化菌株，編號為ts916，保存于泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。

1．1．2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g、瓊脂 20 g，加水定容至1 L。121℃滅菌30 min，每平板定量為20 mL。

1.2 菌株鑒定

1．2．1 菌株純化

采用組織分離法得到野生子實體的PDA純培養(yǎng)物。經(jīng)過3次純化（25℃恒溫避光培養(yǎng)，單次培養(yǎng)時間為10 d～15 d） 培養(yǎng)獲得菌絲純培養(yǎng)物，編號為ts916。菌絲純培養(yǎng)物保藏于4℃冰箱備用。

1．2．2 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定采用宏觀形態(tài)特征與顯微結(jié)構(gòu)相結(jié)合的方法。參照《中國大型真菌》[2]對ts916菌株子實體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，對照觀察子實體及附屬物等外觀特征，以及是否有特殊氣味；挑取試管中保藏的菌塊于PDA平板培養(yǎng)基上活化，每天觀察菌落特征直至菌落長滿平板；用插片法顯微觀察菌絲、孢子等特征。

1．2．3 分子生物學(xué)鑒定

1） ITS序列擴(kuò)增與測序

采用真菌總DNA提取試劑盒提取菌絲DNA，后使用真菌ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為 ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR 反應(yīng)體系 50 μL：模板 1 μL （約 20 ng），2 × PCR Taq Master Mix 25 μL，0．4 nmol·L-1正向引物和反向引物各1 μL，ddH2O補足至50 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃補平7 min；4℃終止反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA純化、測序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心完成。

2）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測得的ITS序列用DNAMAN進(jìn)行拼接，將拼接后的ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，BLAST檢索獲得多條同源性較高的rDNA ITS參考序列，使用MEGA 7．0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3 菌株液體培養(yǎng)基篩選

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]的配方進(jìn)行調(diào)整，5種液體培養(yǎng)基的配方見表1。

表1 液體培養(yǎng)基配方Tab．1 The formulas of liquid culture media

如表1所示，配方中去皮馬鈴薯、玉米粉、麥麩用沸水煮30 min，4層紗布過濾。依次加入其他材料，加水定容至1 L。分裝至250 mL三角瓶中，每瓶裝液量為150 mL，每種液體培養(yǎng)基重復(fù)5次。滅菌冷卻至室溫后，每個三角瓶中接種大小約為0．5 cm3的菌塊5塊。接種后置于恒溫?fù)u床140 r·min-1，25℃培養(yǎng)7 d。觀察記錄菌液顏色、氣味和密度。培養(yǎng)完成后55℃烘箱烘干菌絲至質(zhì)量恒定，以每100毫升液體培養(yǎng)基中所含的菌絲體干質(zhì)量（g）為指標(biāo)計算其生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

供試ts916菌株的子實體形態(tài)特征見圖1。

圖1 野生菌株ts916子實體Fig．1 Fruit body of wild strain ts916

如圖1所示，野生菌株ts916子實體群生或近叢生，子實體中等；菌蓋直徑為3 cm～8 cm，幼時呈半球形，后平展，邊緣內(nèi)卷，新鮮時為白色或淡紫色；菌肉為淡紫色，較薄，呈水浸狀；菌褶直生，不等長；菌柄長度為 4．0 cm～6．5 cm，直徑為 0．3 cm～1．2 cm，紫色，實心，基部多彎曲。春季和秋季多見于山坡草地、菜園、火燒地等處，可形成蘑菇圈。有獨特蘑菇香味。

菌種ts916經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，菌絲呈白色，絨毛狀，后期逐漸變?yōu)樽仙z濃密，氣生菌絲茂盛。培養(yǎng)后期會產(chǎn)生色素，培養(yǎng)基變?yōu)樽仙＜s12 d～16 d菌絲可長滿整個平皿。

菌絲及孢子的顯微結(jié)構(gòu)特征見圖2。

圖2 野生菌株ts916顯微結(jié)構(gòu)Fig．2 Microstructure of wild strain ts916

由圖2可知，光學(xué)顯微鏡下觀察ts916菌株的菌絲體形態(tài)顯示，其菌絲無色透明，具有鎖狀聯(lián)合。孢子無色，呈橢圓形至卵圓形。

2.2 分子鑒定

對菌株ts916的rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，獲得長度為660 bp的DNA片段，將獲得的ITS序列上傳至NCBI獲得序列號MG516585，并進(jìn)行BLAST比對。從NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)下載已知的多條相似序列作為參考序列，以卵孢奧德蘑Oudemansiella raphanipes（MT974249） 為外群，并運行1 000次以Bootstrap檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性，運用MEGA 7．0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，詳見圖3。

圖3 基于rDNA ITS構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．3 NJ Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences

由圖3可知，鄰接聚類分析表明香蘑屬內(nèi)多個菌株以較高的支持率聚成3支，其中菌株ts916與數(shù)據(jù)庫中的Lepista sordida聚為一大支；與中國江西、貴州、江蘇的3個菌株（序列號分別為MN258660、MZ158191、FJ481015） 親緣關(guān)系更近，ITS核苷酸一致率為99．82%～100．00%；與日本、埃及、中國黑龍江的3個菌株（序列號分別為 KP293583、LN827702、KF874612） 親緣關(guān)系較近，ITS核苷酸一致率為97．95%～98．00%。依此結(jié)果將ts916菌株鑒定為花臉香蘑Lepista sordida。

2.3 液體培養(yǎng)基篩選

取10 mL液體培養(yǎng)的菌液于平板中，觀察菌株ts916在5個液體培養(yǎng)基配方中的生長情況，見圖4，菌絲體生物量等指標(biāo)結(jié)果見表2。

圖4 菌株ts916在5個液體培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 Growth situations of strain ts916 cultivated in five liquid cultrue media

表2 不同液體培養(yǎng)基配方對ts916菌株菌絲體生長的影響Tab.2 Effect on mycelial growth conditions of strain ts916 in different liquid media

由圖4、表2可知，菌株ts916菌絲在5個配方中菌絲體生物量依次為：配方4>配方2>配方5>配方3>配方1。在配方4中生長最好，菌絲球表面光滑，大小均一，稠密；菌絲體生物量最大，達(dá)2.209g·100-1mL-1。

3 討論與結(jié)論

通過使用子實體形態(tài)鑒定和rDNA ITS序列分子鑒定相結(jié)合的方法，確定所分離的野生菌株ts916為花臉香蘑，為該地區(qū)花臉香蘑育種工作提供遺傳背景清晰的野生種質(zhì)資源。

在云南、四川等地有每年采食花臉香蘑的習(xí)慣，但花臉香蘑具有人工栽培周期長、生物學(xué)效率低、子實體易碎、蟲害重等問題限制其規(guī)模化、商品化發(fā)展，因此菌種的快速擴(kuò)繁等栽培技術(shù)仍是今后花臉香蘑的研究重點。因此，對菌株ts916的液體培養(yǎng)基進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果表明，菌株ts916的最適液體培養(yǎng)基為配方4（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母膏3 g、玉米粉20 g、麩皮20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 L，pH自然）。在其他研究中，羅倩[12]得到的花臉香蘑HL-07菌絲體液體發(fā)酵最佳條件為蛋白胨0.1%、玉米粉2%；鄧功成[13]研究得到花臉香蘑液體發(fā)酵最佳條件為玉米粉3%、酵母膏0.2%；胡先運[14]采用正交試驗的方法，篩選出適合于花臉香蘑深層發(fā)酵培養(yǎng)的配方為，最佳碳源為土豆粉，最佳氮源為NH4Cl，pH為7，無機(jī)鹽為FeSO4，菌齡12 d。對于花臉香蘑最適液體條件的選擇，結(jié)果有所不同。其原因可能是：1） 最佳液體培養(yǎng)條件的選擇與品種有關(guān)；不同品種的花臉香蘑的最佳液體培養(yǎng)條件不同。2） 試驗設(shè)計時選擇的配方和試驗方法不同；一些試驗中，通過單因素法選擇出1種最佳碳源或氮源。但實際生產(chǎn)中，常根據(jù)經(jīng)濟(jì)情況或就地取材，復(fù)合氮源在生產(chǎn)上較為常用。研究中酵母膏、麩皮、玉米粉的復(fù)配效果比單獨使用麩皮（配方2） 或玉米粉（配方3） 好。在雙孢菇（Agaricus bisporus）[15]、大球蓋菇 （Stropharia rugosoannulata）[11]等食用菌的液體培養(yǎng)基篩選中也發(fā)現(xiàn)，復(fù)配氮源可使菌絲球大小均勻、干質(zhì)量大。

綜上，在豐富花臉香蘑的種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，探索出菌絲的生長條件和營養(yǎng)要求，為下一步馴化選育和市場化開發(fā)提供技術(shù)條件。