9 種引進櫟屬植物遺傳多樣性及親緣關系的ISSR 分析

余敏芬，梅家琪，何立平，李東賓，徐棟斌，楊影，袁虎威，閆道良，鄭炳松

（1.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 浙江省森林芳香植物康養功能研究重點實驗室，浙江 杭州 311300；3.寧波市林場，浙江 寧波 315440）

櫟屬Quercus是殼斗科Fagaceae 中分布最廣、種類最多的屬，主要分布在亞洲、非洲、歐洲以及美洲地區[1]。如我國的栓皮櫟Q.variabilis，從遼寧省南部到云南省中部皆有分布，并且分布的海拔上限從北到南不斷增加[2]，橫跨亞熱帶、熱帶[3]。與其它樹種相比，櫟屬植物應用頗多。櫟屬植物的木材堅硬。趙涇峰等[4]發現陜西4 種櫟屬植物的木材皆可用作實木地板和建筑材料。櫟屬Quercus樹種又稱橡樹，其種子被稱作橡子。橡子可以食用，營養豐富。魏練平等[5]測定了安徽黃山出產的橡子粉，其淀粉含量高達83.24%。橡子亦可用于釀酒。據報道，將橡子粉和糯米以一定的比例混合發酵，可以產生大量酒精，成品酒中富含糖分、有機酸，還含有氨基酸、礦質元素和維生素等[6]。由此可見，櫟屬植物具有巨大的開發利用價值。

鑒定不同櫟屬植物的遺傳多樣性和親緣關系是對其進行有效利用的基礎和前提。分子標記是分析物種遺傳多樣性和親緣關系的有力工具。在眾多分子標記中，簡單序列重復間擴增（inter-simple sequence repeat，ISSR）標記是目前最有效的分子標記之一[7]，具有操作簡單、多態性高、經濟方便等優點。ISSR 標記是以在簡單重復序列的末端加2～4 個隨機核苷酸序列為引物，通過PCR 反應在簡單重復序列間進行擴增的標記技術[8]。ISSR分子標記可用于分子輔助育種、親緣關系分析和遺傳多樣性分析等多個方面。目前，已有大量研究利用ISSR 分子標記對植物進行親緣關系分析和遺傳多樣性分析。廖菊陽等[9]利用ISSR 標記對28 種杜鵑屬Rhododendron植物進行了分析，擴增出127 個多態性位點，多態性比例高達96.21%，并以平均相似系數0.588 為閾值，將28種杜鵑屬植物分為三個類群。曾惠敏等[10]利用ISSR 標記對14 個八仙花（繡球Hydrangea macrophylla）品種進行分析，計算出的14 個八仙花品種的遺傳相似系數皆大于0.9，表明了其相近的親緣關系，并在遺傳相似性系數約0.38 處將14 個八仙花品種分為兩類。李杉杉[11]等利用ISSR 標記對20 個種質的紫花苜蓿Medicago sativa進行遺傳多樣性分析，其多態性條帶比率達82.67%。禹靚倩等[12]采用ISSR 分子標記分析了27 個櫟屬樹種的親緣關系，利用12 條引物擴增出140 個位點，其中多態性位點比率為82.14%，將27 個櫟屬樹種分為5 類。Coutinho等[13]利用ISSR 分子標記分析了國外部分櫟屬資源的遺傳多樣性和親緣關系，為其開發利用奠定了基礎。

近年來，我國從國外引進了一些櫟屬植物，但對這些櫟屬植物的遺傳多樣性和相對親緣關系還不清楚，限制了其在我國的開發利用。本文擬用ISSR 分子標記技術對9 種從國外引進的櫟屬植物（種或品種）進行遺傳多樣性分析和親緣關系分析，以期為從國外引種的櫟屬植物的有效利用提供科學依據并奠定堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2017 年10 月，寧波市林場從海寧俄勒崗苗木繁育技術有限公司引進‘針櫟’Q.palustris‘Pin Oak’、‘猩紅橡木’Q.coocinea‘Scarlet Oak’、‘太平洋光輝’Q.palustris‘Pacific Brilliance’、‘沼澤白橡木’Q.icolor‘Swamp White Oak’、‘北方紅橡’Q.rubra‘Red Oak’、‘綠柱’Q.palustris‘Green pillar’ 6 個櫟屬品種（均為海寧俄勒崗苗木繁育技術有限公司2014 年從美國引入）地徑為2～5 cm 的實生苗，按4 m×4 m 株行距在露地無保護狀態下栽培。種植試驗地的海拔為730 m，面積為0.67 hm2。2017 年11 月，寧波市林場從湖南長沙引進柳葉櫟Q.phellos和2 種娜塔櫟Q.nuttallii種質（紅葉娜塔櫟和綠葉娜塔櫟）苗木，均為早期從北美引進種子進行播種培育的5 年生實生苗。這些櫟屬品種引進后均生長良好，能在寧波市林場基地正常萌芽、生長、變色和落葉，但部分櫟屬品種冬天易受雪壓折斷，部分出現病蟲害，還在進一步觀察和研究中。

本文以這9 種國外引進的櫟屬植物的葉片為實驗材料，葉片于2018 年5 月9 日采自寧波市林場種植基地，多株混合采樣，樣品采集后立即放入液氮中暫存，隨后帶到浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室，在－80℃超低溫冰箱中保存以用于后續測定。9 種櫟屬植物的基本信息如表1。

表1 9 種國外引進櫟屬植物的基本信息Table 1 Morphological traits of introduced nine species/cultivars of Quercus

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取及質量檢測 參考王玲玲等[14]的方法，利用改良CTAB 法提取櫟屬植物葉片基因組DNA。每個樣品至少進行3 次重復提取。提取后用NanoDrop-1000 分光光度計檢測DNA 的濃度和純度（OD260/280）；用質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質量。

1.2.2 ISSR引物的篩選及PCR擴增 基于前人的研究[15-17]，結合加拿大哥倫比亞大學報道的100條櫟屬植物ISSR引物，從中篩選出26 條引物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。根據公司提供的引物的Tm 值，設定合適的退火溫度，具體信息如表2。

表2 ISSR 引物信息Table 2 The ISSR primers used in this study

以提取的9 份櫟屬植物的DNA 為PCR 反應的模板，分別用26 條引物進行產物擴增。PCR 反應體系共25.0 μL，包括櫟屬植物DNA 0.5 μL、ISSR 引物2.0 μL、rTaq 酶12.5 μL。反應體系中的rTaq Mix 為預混型rTaq 酶（日本，Takara），其中包含了DNA 聚合酶、Mg2+、反應緩沖液、dNTP 等成分。ISSR-PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，依據表5 中的Tm 值退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物用質量分數為1.5% 的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，恒壓135 V 電泳35 min，在紫外凝膠成像系統中觀察電泳條帶并拍照。每個樣品的PCR 擴增至少進行3 次重復，以減少誤差。

1.3 數據統計分析

電泳條帶記錄時，用數字“1”表示電泳圖中某孔道在該行中存在條帶，用數字“0”表示電泳圖中某孔道在該行中不存在條帶。根據條帶統計結果，用分析軟件NTsys-pc 2.10e 計算9 種櫟屬植物之間的遺傳相似系數，并基于遺傳相似系數進行聚類分析，聚類方法選用UPGMA。

2 結果與分析

2.1 9 種櫟屬植物的ISSR 擴增結果

用26 條ISSR 引物（見表2）對9 種櫟屬植物的基因組DNA進行PCR擴增。經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，共篩選出23 條擴增條帶清晰、多態性高的ISSR 引物。以4 號引物UBC-810 所擴增結果為例，9 種櫟屬植物在該引物擴增位點的多態性較高，共擴增出18 條電泳條帶，其中多態性條帶有17 條，多態性條帶百分率達94.44%（圖1），初步顯示了9 種櫟屬植物間的遺傳差異。

圖1 9 種櫟屬植物的ISSR 擴增結果（以4 號引物UBC-810 為例）Figure 1 ISSR amplification bands of the introduced nine species of Quercus (primer: UBC-810)

2.2 9 種櫟屬植物的ISSR 遺傳多樣性

以擴增條帶清晰、多態性高的23 條ISSR 引物進行9 種櫟屬植物間的遺傳多樣性分析，發現23 條引物共擴增出319 條條帶，除UBC-879 僅擴增出3 條條帶以外，其它每條引物至少擴增出了9 條條帶，其中引物UBC-845 擴增出的條帶數最多（為20 條），平均每個引物擴增出13.87 條條帶。在319 條擴增條帶中，298 條為多態性條帶，平均多態性條帶百分率為93.42%。在23 條引物中，多態性條帶百分率最低的為66.67%（3 號引物），最高的為100%（共有11 條引物）（表3），表明這9種櫟屬植物的遺傳多樣性較為豐富。

表3 9 種櫟屬植物在23 條ISSR 引物位點上的擴增條帶統計Table 3 Bands amplified by the 23 ISSR polymorphic primers of nine introduced species of Quercus

2.3 9 種櫟屬植物的親緣關系分析

從9 種櫟屬植物的遺傳相似系數分析結果可以看出，除了Q6 (‘沼澤白橡木’)與其它櫟屬植物的遺傳相似系數在0.485 9～0.558 0 外，其它8 種櫟屬植物互相之間的遺傳相似系數都在0.605 0～0.764 9（表4）。由此可以說明‘沼澤白橡木’與其它8 種櫟屬植物的親緣關系最遠。在9 種櫟屬植物中，遺傳相似系數最大，即兩個品種間親緣關系最近的是Q9 (‘綠柱’)和Q4 (‘太平洋光輝’)，兩者間的遺傳相似系數為0.764 9，與其同屬于沼生櫟品種的客觀事實相符。

表4 9 種櫟屬植物的遺傳相似系數Table 4 Genetic similarity coefficients of the nine introduced species of Quercus

根據遺傳相似系數對9 種櫟屬植物進行聚類分析，結果見圖2。由圖2 可知，在遺傳相似系數0.650 處，9種櫟屬植物可分為3 類，其中3 個沼生櫟品種（‘綠柱’‘太平洋光輝’和‘針櫟’）和2 種娜塔櫟種質（紅葉娜塔櫟和綠葉娜塔櫟）被歸為第一類，柳葉櫟、‘猩紅橡木’以及‘北方紅橡’被歸為第二類，而‘沼澤白橡木’單獨歸為第三類。在第一類中，‘綠柱’和‘太平洋光輝’沼生櫟兩者之間的親緣關系最近?！訚砂紫鹉尽推渌? 種櫟屬植物的親緣關系最遠。

圖2 基于遺傳相似系數的9 種櫟屬植物UPGMA 聚類Figure 2 UPGMA dendrogram of the nine introduced species of Quercus based on genetic similarity coefficients

3 結論與討論

櫟屬植物具有重要的開發利用價值[18-19]。世界上的櫟屬植物約有300 種，我國僅有51 種，因此，引進并合理開發利用國外優良櫟屬種質資源對于豐富我國櫟屬種質資源并促進其開發利用具有重要意義。近年來，我國從國外引進了一些櫟屬植物資源，但對其開發利用水平有限。充分利用國外優良櫟屬種質資源的優勢提升我國櫟屬植物的遺傳改良水平對于促進我國櫟屬植物的開發利用具有積極影響。了解國外引進櫟屬植物的相對親緣關系和遺傳多樣性，是將其應用到我國櫟屬植物遺傳改良進程中的基礎性工作。

分子標記技術是對植物種質資源進行親緣關系分析和遺傳多樣性評價的有效技術手段。在多種分子標記中，ISSR 分子標記是最簡便有效的分子標記之一，被廣泛應用于輔助選育[20]、品種鑒定[21]、種質資源評價、遺傳多樣性研究[22]、遺傳圖譜構建[23]以及親緣關系分析[24]等多個方面。ISSR 分子標記在多個物種的親緣關系分析和遺傳多樣性分析上具有廣泛應用。王志清[25]等采用ISSR 標記分析了61 份細辛Asarum sieboldii種質的遺傳多樣性，其多態性條帶的比例為86.3%。原勤勤等[26]對38 個優良棗Ziziphus jujuba品種進行了親緣關系分析，發現品種間的親緣關系與地理位置密切相關。寧靜等[27]對110 個株系的黃金茶Camellia sinensis‘Huangjincha’ 進行了親緣關系分析和遺傳多樣性分析，共獲得187 個多態性條帶，多態率高達91.22%，并在遺傳相似系數平均值0.55處，將黃金茶分為7 個類群。嚴華[28]等利用ISSR 分子標記對38 個品種的國蘭（蘭科Orchidaceae 蘭屬Cymbidium植物）進行了親緣關系分析，得出的親緣關系聚類圖與傳統分類的結果基本一致，并選用其中兩個品種進行雜交實驗，獲得其成形的干果。由此也說明了ISSR 分子標記在親緣關系分析、遺傳多樣性評價、指導植物輔助育種等方面具有一定的可行性。

本研究選用23 條ISSR 引物，利用PCR 技術對9 種國外引種的櫟屬植物進行遺傳多樣性分析和親緣關系分析，共擴增出298 條多態性條帶，其多態性條帶比例達93.42%，其中擴增出多態性條帶的比率為100%的引物有11 條，表明這9 種櫟屬植物的遺傳多樣性較高。禹靚倩等對27 種櫟屬樹種親緣關系的分析發現，利用12 條ISSR 引物擴增出140 個位點，其中多態性位點比率為82.14%[12]。本文研究結果發現基于ISSR 分子標記的櫟屬植物的多態性條帶比率均超過80%，顯示了所研究的櫟屬植物具有較高的遺傳多樣性；同時，本文研究的9 種國外引進櫟屬植物的多態性條帶比例為93.42%，顯著高于前人對27 種櫟屬樹種的研究，顯示了國外引進的9種櫟屬植物的較高遺傳多樣性，這也為其在國內櫟屬植物遺傳改良中的應用奠定了堅實的材料基礎。

本研究利用ISSR分子標記，從分子水平上揭示9種國外引進的櫟屬植物的親緣關系。從遺傳相似系數來看，在遺傳相似系數為0.650 處，可將9 種櫟屬植物分為3 類，其中‘沼澤白橡木’和其它8 種櫟屬植物的親緣關系最遠，而3 種沼生櫟（‘綠柱’‘太平洋光輝’和‘針櫟’）之間的親緣關系最近，ISSR 親緣分析聚類結果與傳統分類結果相似。從表型特征上看，‘綠柱’‘太平洋光輝’和‘針櫟’三者的樹形、秋色、樹高等表型特征較為接近，但仍能在分子水平上檢測出它們之間的差別，說明根據形態學特征，個體之間沒有較大差異的品種，利用ISSR 標記仍能鑒別出其在分子水平上的差別。但值得注意的是，2 個娜塔櫟種質的表型特征相近，最顯著的區別僅為葉色，但從分子水平上看，綠葉娜塔櫟種質與3 個沼生櫟品種的親緣關系更近。因此，不能僅僅依據物種的表型特征來判斷物種之間的親緣關系。建議對于親緣關系的分析，應該結合分子標記、形態學標記等多種遺傳標記綜合考慮，進而分析確定物種以及品種之間的親緣關系。當然，當前的分類結果是基于少數ISSR 位點的多態性，通量較低，可能對親緣分析結果有一定的影響，未來可應用更多的標記進行進一步分析。在未來育種過程中，參考本文的分析結果，利用親緣關系較遠的品種進行雜交可創造更為優良的種質資源，從而保證育種群體的遺傳多樣性，促進櫟屬植物應用的可持續發展。