羅伊氏乳桿菌CCFM8631對由膽堿導致的血漿氧化三甲胺和盲腸三甲胺水平升高的影響

王茜茜，張婷，梁明*，趙建新，張灝，王剛*，陳衛

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州，510645)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)主要包括缺血性心臟病和中風等，是造成人類死亡的主要原因，也是致殘的重要因素[1-2]。我國是全球CVDs死亡人數最高的國家，并呈逐年上升的趨勢。在針對我國各省健康情況的全球疾病負擔2017中指出，我國死亡率最高的疾病是中風和缺血性心臟病，中風從1990年的第三位上升為2017年的首位，缺血性心臟病從1990年的第七位上升到2017年的第二位[3]。2016年，約400萬人死于CVDs[4]。目前CVDs已經成為一種全球性的疾病。

最近的證據表明，腸道微生物能夠通過調節宿主代謝和炎癥的方式進一步促進或預防CVDs以及相關疾病的發生發展。越來越多的證據表明，腸道微生物的組成會影響宿主的新陳代謝[5]。紅肉、貝類、雞蛋中含有豐富的膽堿、磷脂酰膽堿和L-肉堿[6]。這些食品經過腸道菌群的作用，生成三甲胺(trimethylamine，TMA)，然后在肝臟中在黃素單氧化酶(flavin-containing monooxygenase，FMO)(特別是FMO1和FMO3)的作用下被轉化成氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)[7]。最近的研究表明，TMAO能夠促進動脈粥樣硬化的發生發展，是CVDs的始動因素[8-9]。TMAO與心血管事件、預后和死亡風險均相關[10]。

隨著腸道菌群與慢性疾病的研究不斷增多，服用益生菌作為一種潛在的緩解及預防方式，越來越多地受到人們的關注。QIU等的研究發現植物乳桿菌ZDY04[11]和產氣腸桿菌ZDY01[12]可以通過改善小鼠腸道菌群結構的方式減少血漿TMAO和盲腸TMA含量，進而減少CVDs的發生。本研究選取3株不同種的乳桿菌，通過高膽堿飲食模型，評價它們降低血漿TMAO和盲腸TMA的效果，以期為CVDs防治開發新的功能性乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

TMAO、TMA，Sigma-Aldrich公司；D9-TMAO，Cambridge公司；D9-TMA，Toronto Research Chemicals公司；小鼠肝臟FMO3、法尼酯X受體(recombinant farnesoid X receptor，FXR)的ELISA試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司；膠回收試劑盒，杭州倍沃醫學科技有限公司；PCR引物，上海生工生物工程有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，美國MP Biomedicals公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate,BCA)蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

5424R高速離心機，德國艾本德股份公司；HPLC-MS/MS，賽默飛世爾科技公司；MiSeq測序儀，美國Illumina公司。

1.2 實驗菌株

本實驗使用的3株乳桿菌均來自江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心，菌株信息見表1。

表1 乳桿菌信息表Table 1 Lactobacillus strains information

1.3 實驗動物及飼料

7周齡的無特定病原體級(specific pathogen-free，SPF)雌性C57BL/6 J小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，適應1周后，開始進入正式實驗，實驗周期是4周[11]。小鼠標準飼料(LAD 3001M，膽堿質量分數為0.1%)，1.0%膽堿飼料(LAD 3001M，膽堿質量分數為1.0%)，購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的培養及懸浮液的制備

本動物實驗所用到的3株乳桿菌均利用MRS培養基進行活化，使用之前以3%的接種量進行菌體活化，連續活化3代，活化之后擴大培養，6 000×g離心15 min收取乳桿菌的菌體。用預冷的0.9%生理鹽水對乳桿菌的菌體清洗3次，以同樣的離心條件收取乳桿菌的菌體。獲得的菌體利用預冷的30%的蔗糖溶液重懸，進行菌落計數，保存于-80 ℃冰箱備用。使用時用預冷的無菌生理鹽水對乳桿菌菌體清洗3次，并用無菌生理鹽水將菌液稀釋到活菌數為1×109CFU/mL。

1.4.2 動物分組與處理條件

實驗動物方案見表2。實驗小鼠飼養于江南大學實驗動物中心SPF級屏障中的IVC籠盒中[溫度為(25±2) ℃，濕度為(50±5)%，循環光照，其中12 h光照，12 h黑暗]，實驗過程中所有小鼠均自由飲食飲水。所有動物實驗均通過江南大學倫理委員會審閱和批準，且符合歐盟保護實驗動物條例(2010/63/EU)，所有實驗均在江南大學實驗動物中心完成。倫理審核編號為：JN.No20181215c0900530[270]。

表2 動物實驗設計Table 2 Animal experimental scheme

1.4.3 動物解剖及組織處理

實驗結束前收集小鼠糞便保存于-80 ℃冰箱備用。實驗最后階段，小鼠禁食禁水過夜后在小鼠腹腔注射100 mg/kg體重的1%的戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，摘眼球取血，靜置30 min后，3 000×g離心20 min取血漿，分裝后置于-80 ℃保存。小鼠解剖后，肝臟、腎臟和脾臟稱重后被迅速放入液氮中。計算小鼠肝臟、腎臟、脾臟的臟器指數，如公式(1)所示：

(1)

1.4.4 小鼠血漿TMAO的樣品處理

取20 μL血漿樣品加入80 μL(體積比1∶4)乙腈沉淀血漿樣品中的蛋白質，同時加入終濃度為2.0 μmol/L的D9-TMAO到血漿樣品中作為內標。混勻，-80 ℃靜置2 h，在4 ℃條件下12 000×g離心15 min，吸取上清液至進樣瓶中，保存在-80 ℃冰箱備用。采用HPLC-MS/MS進行血漿TMAO的測定[13-14]。

1.4.5 小鼠盲腸TMA的樣品處理

稱取小鼠盲腸內容物，1 mg盲腸內容物加入20 μLV(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶40∶20的混合溶液，同時加入終濃度為2.0 μmol/L的D9-TMA到盲腸樣品中作為內標，振蕩混勻后在-80 ℃靜置2 h，在4 ℃ 條件下12 000×g離心15 min，吸取上清液至進樣瓶中，保存在-80 ℃冰箱，采用HPLC-MS/MS進行盲腸TMA的測定[11]。TMA是極易揮發的小分子。在樣品制備和檢測過程中應快速操作，整個過程應保持低溫。樣本隨機檢測，以盡量減少由于處理時間造成的誤差。

1.4.6 HPLC-MS/MS檢測TMAO、TMA、D9-TMAO以及D9-TMA含量

參考之前文獻報道的方法[13-14]，利用Q Exactive的HPLC-MS/MS分析TMAO、TMA、D9-TMAO以及D9-TMA含量。液相色譜采用Amide色譜柱進行分離，流動相A：0.1 mmol/L的甲酸銨(pH 3.5)，流動相B：乙腈，流速：0.3 mL/min。采用梯度洗脫的方式進行洗脫。質譜參數如下：離子源：ESI；多反應監測；正離子掃描。樣品檢測參數如表3所示。

表3 標準品檢測參數Table 3 Standard testing parameters

1.4.7 小鼠肝臟FMO3和FXR蛋白的測定

小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白含量按照Elisa試劑盒(上海酶聯)的操作手冊進行測定。

1.4.8 小鼠肝臟FMO酶活力的測定

按照之前文獻報道的方法檢測肝臟FMOs的活性[15]。具體操作如下：小鼠肝臟組織在含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液中破碎勻漿，待肝臟組織裂解完全，根據BCA蛋白定量試劑盒的操作說明測定蛋白質含量。取1.0 mg肝臟蛋白質加入D9-TMA使其終濃度為100 μmol/L，同時加入100 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸混合均勻，最后加入10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH 7.4)緩沖液得到250 μL反應體系。37 ℃孵育8 h后，加入0.2 mol甲酸終止反應，隨后過濾樣品(ValueLab filter PTFE-Q 0.2 μm，安捷倫)轉移到進樣瓶，保存在-80 ℃冰箱，采用HPLC-MS/MS檢測生成的D9-TMAO的含量。

1.4.9 16S rDNA擴增子測序

小鼠糞便DNA按照試劑盒的說明書進行操作，細菌的16S rDNA的擴增、純化、定量、混樣、文庫構建及測序分析等參考之前的研究[16]。測序完成后，在QIIME2(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，QIIME2,version 2019.7,https://view.qiime 2.org/)[17]進行物種分類注釋，并利用在線網站進行微生物群落的α多樣性和β多樣性分析[18]、線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)[19]及菌群與TMAO/TMA之間的相關性分析[20]。

1.5 數據統計分析

本論文中，所有的實驗數據均采用平均值±標準差的形式表示，通過GraphPad Prism 6.0軟件繪制統計分析圖，通過SPSS(IBM SPSS Statistics 22)對各組平均值的差異進行單因素方差分析，當P<0.05時，數據具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌的攝入對高膽堿飼料飼養小鼠臟器指數的影響

實驗結束后，比較了不同組之間小鼠的肝臟指數、腎臟指數和脾臟指數。如圖1所示，對照組與膽堿組之間沒有統計學差異，乳桿菌的攝入對膽堿飼料飼養小鼠的臟器指數也沒有統計學上的影響。

a-肝臟指數；b-腎臟指數；c-脾臟指數圖1 小鼠臟器指數Fig.1 Organ indices of mice

2.2 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對高膽堿飼料飼養的小鼠血漿TMAO和盲腸TMA水平的影響

如圖2所示，與對照組相比，膽堿組血漿TMAO水平和盲腸TMA水平顯著升高，乳桿菌的攝入對血漿TMAO水平和盲腸TMA水平的影響各不相同，表現出菌種的特異性[21]。其中，羅伊氏乳桿菌CCFM8631可以顯著降低血漿TMAO水平和盲腸TMA水平。這也預示著羅伊氏乳桿菌CCFM8631具有降低CVDs發病風險的潛力。

2.3 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對高膽堿飼料飼養的小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白表達和FMOs酶活力的影響

如圖3所示，對照組和膽堿組之間，肝臟FMO3和FXR的蛋白表達沒有差異，乳桿菌的攝入，也沒有顯著影響FMO3和FXR的蛋白表達。進一步測定肝臟FMOs的活性,如圖3-c所示，對照組和膽堿組的肝臟FMOs酶的活性沒有顯著差異。與膽堿組相比，乳桿菌的攝入，也沒有顯著影響肝臟FMOs酶的活性。

a-血漿TMAO水平；b-盲腸TMA水平圖2 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對降低血漿TMAO和盲腸TMA水平的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on decrease the levels of plasma TMAO and cecal TMA in mice注：與膽堿組相比，*表示P<0.05，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1(下同)

2.4 羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對高膽堿飼料飼養的小鼠糞便菌群的影響

2.4.1 小鼠糞便菌群多樣性分析

為了探究羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對膽堿飼料飼養的小鼠腸道菌群的影響，我們對小鼠的糞便樣品進行了16S rDNA分析。由圖4-a可知，通過對小鼠糞便菌群進行α多樣性分析發現，與對照組相比，膽堿組在觀測物種豐富度指數，香農多樣性指數，Pielou均勻度指數和Faith系統發育多樣性指數方面均沒有顯著性差異，這預示著膽堿飼料并未影響糞便菌群的α多樣性。但是乳桿菌的攝入影響了糞便菌群的α多樣性，羅伊氏乳桿菌CCFM8631顯著升高了觀測物種豐富度指數。這也預示著羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入增加了腸道內菌群的豐富度。通過對小鼠糞便菌群進行β多樣性分析，由圖4-b可知，不同組之間分布較集中，沒有顯著的差異，說明膽堿飼料和羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對菌群的組成結構沒有顯著的影響。

2.4.2 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對小鼠腸道菌群門水平相對豐度的影響

在門水平上，如圖5所示，在所有實驗組中，相對豐度較高的門是一致的，均是厚壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌門(Actinobacteria)。說明膽堿飼料和羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對小鼠腸道菌群門水平的相對豐度沒有影響。

a-肝臟FMO3蛋白表達水平；b-肝臟FXR蛋白表達水平；c-肝臟FMOs酶活力圖3 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白表達和FMOs活性的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on affect the expression levels of FMO3 and FXR and the enzyme activity of hepatic FMOs

2.4.3 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對小鼠腸道菌群屬水平相對豐度的影響

通過Galaxy軟件對小鼠糞便菌群進行LEfSe分析，設定差異閾值為LDA>2，P<0.05，共鑒定出具有顯著性差異的屬8個，如圖6-a、圖6-b所示，它們分別分布在對照組和CCFM8631組中。將篩選出具有顯著性差異的8個屬與血漿TMAO和盲腸TMA進行Pearson相關性分析，如圖6-c所示，可以看出RuminococcaceaeUCG-013的豐度與盲腸TMA水平呈顯著正相關，Parasutterella的豐度與血漿TMAO水平呈顯著負相關，并且與盲腸TMA也表現出負相關的趨勢。具有相關性趨勢的屬的相對豐度如圖6-d所示，可以看出，在屬水平上，與對照組相比，膽堿組顯著提高了RuminococcaceaeUCG-013的相對豐度，顯著降低了Parasutterella的相對豐度，但是羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入改善了這一變化。

a-α多樣性分析；b-β多樣性分析圖4 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對菌群多樣性的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on the diversity of gut microbiota

3 討論

膽堿是一種人體必需的微量營養素，在人體代謝中發揮著廣泛的作用，參與了磷脂相關的細胞膜信號、與脂蛋白相關的脂質轉運、與同型半胱氨酸減少相關的甲基代謝以及與乙酰膽堿相關的神經遞質合成[22-23]。含膽堿食物(如雞蛋、紅肉、魚類、貝類等)中的膽堿可以被腸道吸收[22]。長期缺乏或過量攝入膽堿均會對人體健康造成損害。例如，長期缺乏膽堿會損害肝功能，導致線粒體功能障礙、活性氧介導的DNA損傷、脂質代謝紊亂和磷脂酰膽堿合成[24-25]。但是，長期過量累積膽堿會增加CVDs的發病風險。膽堿是含有三甲胺基團的化合物，經腸道微生物代謝產生TMA，TMA經肝臟FMO的作用迅速進一步氧化成TMAO，這會導致動脈粥樣硬化等疾病的發生，增加CVDs的發病風險[6]。如今，新出現的證據表明，對人體有害的可能是有毒性的TMA，而不是TMAO[26]。有效降低血漿TMAO和盲腸TMA濃度的益生菌可能為預防動脈粥樣硬化和降低TMA引起的毒性提供有效且安全的方法。

a-門水平上的微生物分布；b-門水平上相對豐度圖5 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對門水平的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on phylum level of gut microbiota

肝臟FMO3在TMA生成TMAO的過程中起著極其重要的作用，肝臟FMO3過表達可以顯著增加血漿的TMAO水平。FMO3的表達受膽汁酸的影響，其中包括膽汁酸激活核受體FXR[15]。在本研究中，血漿TMAO水平和盲腸TMA水平的降低與小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白表達和FMOs的活力無關，最可能的原因是乳桿菌的攝入導致了小鼠腸道菌群的變化，影響了代謝生成TMA的菌群豐度，導致小鼠盲腸TMA水平的降低和血漿TMAO水平的降低。

羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入增加了腸道內菌群的豐富度，雖然對門水平沒有影響，但可以顯著提高Parasutterella屬的相對豐度。Parasutterella是胃腸道健康人群糞便中的核心菌群[27]，羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入顯著提高了糞便Parasutterella的相對豐度，這也預示著該乳桿菌的攝入有助于腸道菌群向著更健康的方向發展。Ruminococcaceae中的成員可以將植物多糖降解為葡萄糖和短鏈脂肪酸，從而刺激葡萄糖和肝臟甘油三酯的產生，增加循環系統中的葡萄糖和脂質水平[28]。有研究指出，Ruminococcaceae的豐度與apoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化病變嚴重程度呈正相關[29]，與血液免疫球蛋白M水平和結腸炎炎癥水平呈正相關[30]。經過膽堿飼料喂養的小鼠，糞便RuminococcaceaeUCG-013的豐度與盲腸TMA水平變化呈現正相關的趨勢，羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入減少了RuminococcaceaeUCG-013的相對豐度，雖然尚無直接證據證明RuminococcaceaeUCG-013能夠代謝膽堿產生TMA，但RuminococcaceaeUCG-013豐度的變化可能調節了腸道內的免疫平衡，維持腸道的健康狀態，減少動脈粥樣硬化的發生。

a-LEfSe結果圖；b-LEfSe分支圖；c-血漿TMAO和盲腸TMA與顯著差異的屬之間的相關性分析；d-屬水平上的相對豐度圖6 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對屬水平的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on genus level of gut microbiota

4 結論

本研究分別用3株不同種的乳桿菌處理膽堿飼料喂養的小鼠4周，發現羅伊氏乳桿菌CCFM8631可以顯著緩解由膽堿導致的血漿TMAO和盲腸TMA含量的升高，這個緩解作用并不是通過影響肝臟FMO3和FXR蛋白的表達以及肝臟FMO的活性實現的，但羅伊氏乳桿菌CCFM8631顯著提高了糞便中Parasutterella屬的相對豐度并降低了RuminococcaceaeUCG-013屬的相對豐度，相關性分析提示這兩個屬的微生物的豐度均與TMA的含量相關，提示羅伊氏乳桿菌CCFM8631可能通過影響了這兩個屬微生物的豐度實現了TMA的降低。雖然本研究中發現了可以減少血漿TMAO和盲腸TMA的生成的羅伊氏乳桿菌CCFM8631，為預防動脈粥樣硬化提供了新的資源，但本研究使用的乳桿菌的種類和數量較少，尚無法得出不同種屬在該功能上的特點。在未來的研究中，要擴大菌株的類別和來源，在開發新的功能性益生菌的同時，對其緩解動脈粥樣硬化的機制進行更深入的探索。