高效降尿酸乳酸菌的篩選及其益生特性研究

呼靜，崔鵬月，雙全

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

人血清尿酸水平高于正常范圍時就會引發(fā)高尿酸血癥或痛風[1]，治療與預防的關鍵是降低尿酸濃度，降低尿酸濃度可通過減少核苷的攝入量或抑制黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)活性來實現(xiàn)。高尿酸血癥的治療和預防手段為服用黃嘌呤抑制劑(別嘌呤醇、非布司他、托匹司他)[2]或排尿酸藥(苯溴馬隆、丙磺舒)[3]，并且輔以嚴格的飲食控制，盡可能減少外源性嘌呤類物質(zhì)攝入。許多研究表明乳酸菌對高尿酸血癥具有治療和預防作用，在腸道內(nèi)乳酸菌可以分解食物中的核苷，降低核苷的含量，進而降低尿酸水平[4]。利用此原理，金方等[5]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌ZM15能夠降解核苷酸與核苷，顯著降低模型大鼠的血尿酸水平。牛春華等[6]在體外篩選出能降解肌苷和鳥苷的植物乳桿菌UA149，其可能通過降低血清XOD活性緩解大鼠高尿酸血癥。WANG等[7]檢測到乳桿菌DM9218能夠降低模型小鼠的血尿酸水平和XOD活性，對小鼠起到治療作用。YAMADA等[8]通過同位素標記、體外HPLC測定和動物模型發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌PA-3表現(xiàn)出較強的腺嘌呤、腺苷和腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)吸收能力，繼而減少尿酸的合成。目前關于乳酸菌調(diào)節(jié)尿酸的研究還相對較少，乳酸菌在高尿酸血癥中的應用前景還沒有得到廣泛的研究。因此，需要尋找高效的天然降尿酸乳酸菌，以輔助治療高尿酸血癥。

本研究旨在通過HPLC法和尿酸生成法評價乳酸菌對核苷的降解及對XOD的抑制作用，并通過耐酸、耐膽鹽、胃腸道轉(zhuǎn)運、黏附性和抗生素敏感性實驗來研究其特性，最終優(yōu)選出可以輔助治療高尿酸血癥的乳酸菌，以豐富我國降尿酸乳酸菌的菌種庫。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

80株乳酸菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院民族特色食品研發(fā)團隊提供。

1.1.2 藥品與試劑

MRS培養(yǎng)基、肌苷、鳥苷、牛膽鹽粉、藥敏紙片，安耐吉化學；KH2PO4、K2HPO4，國藥公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，Coolaber；黃嘌呤，Sigma；XOD、別嘌呤醇，Solarbio；PRMI 1640培養(yǎng)基，Gibco。

1.2 儀器與設備

Agilent LC1260液相色譜儀，美國安捷倫；KG-SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY；58108冷凍高速離心機，德國Eppendorf；FS-150超聲破碎儀，中國Ultrasonic processor公司；JY1002電子天平，上海蒲春計量儀器；細胞培養(yǎng)板，美國Axygen。

1.3 實驗方法

1.3.1 核苷標準曲線的制作

取肌苷-鳥苷-中性磷酸鉀溶液(12.6 mmol/L肌苷-12.6 mmol/L鳥苷-0.1 mol/L K3PO4，pH=7.0)0.9 mL，加入0.1 mL 0.1 mol/L HC1O4振蕩混勻，吸取不同體積(20、15、10、5 μL)微濾膜過濾后用于進樣分析。色譜條件：Agilent LC1260高效液相色譜儀；反相色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm)；流動相為等梯度50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4(pH=6.8)；柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min。在260 nm處測定肌苷與鳥苷含量，并通過曲線插值法進行定量[7]。

1.3.2 篩選高效降解核苷的乳酸菌

采用HPLC法測定反應液中的肌苷和鳥苷含量[9]。將菌株以3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下活化兩代。取乳酸菌培養(yǎng)液2 mL，在4 ℃條件下，5 000 r/min 離心10 min。然后用1 mL PBS洗滌2次，用無菌PBS調(diào)整菌懸液濃度為1×109CFU/mL，重懸于750 μL肌苷-鳥苷-中性磷酸鉀溶液，37 ℃條件下、120 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。將所得菌液在4 ℃條件下、5 000 r/min 離心10 min，所得上清液與HClO4按體積比 9∶1 混合均勻后，取20 μL 用微濾膜過濾后HPLC分析。各菌株對核苷的降解率按照公式(1)計算：

(1)

式中：C1，初始鳥苷(肌苷)標準溶液的濃度，mmol/L；C2，剩余鳥苷(肌苷)標準溶液的濃度，mmol/L。

1.3.3 乳酸菌對XOD的抑制作用

將活化好的菌株于10 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用無菌PBS洗滌2次，用無菌PBS調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，過濾得到細胞代謝物。1×109CFU/mL的菌液，在超聲破碎條件下(200 W、工作5 s停5 s)進行10 min的脈沖破碎，所得液體于10 000 r/min離心10 min，過濾上清液后獲得細胞內(nèi)容物。

利用尿酸生成法[10]測定目的菌株抑制XOD活性作用，XOD可催化黃嘌呤氧化生成尿酸，尿酸在295 nm處有特征吸收峰，以每分鐘295 nm處吸光度的增加來計算酶活性，共記錄10 min。反應體系為1 mL，黃嘌呤200 μL，XOD 200 μL，PBS(pH 7.5)600、550、500、450、400、350 μL，相同濃度的菌體細胞代謝物與內(nèi)容物0、50、100、150、200、250 μL，別嘌呤醇為陽性對照。計算樣品對XOD的抑制率。各菌株的抑制率按照公式(2)計算：

(2)

式中：A，空白組吸光度；B，樣品組吸光度。

1.3.4 酸耐受性測定

參考李堯等[11]的方法，將菌株以3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下活化兩代。分別在pH為6.2(對照組)、2和3的酸性MRS液體培養(yǎng)基中接種1%活化后的菌株，37 ℃下培養(yǎng)3 h，在0、3 h時進行活菌計數(shù)。各菌株的存活率按照公式(3)計算：

(3)

1.3.5 膽鹽耐受性測定

參考任大勇等[12]的方法，將菌株活化好后，按照1%的接種量將菌株分別接種于牛膽粉質(zhì)量分數(shù)為0%(對照組)、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下處理0、3 h后，在0、3 h時進行平板活菌計數(shù)。存活率計算同1.3.4。

1.3.6 胃腸道耐受能力測定

參考SON等[13]的方法，將菌株活化好后，取1 mL 該菌液后加入到9 mL模擬胃液(pH=3.0，3.5 g/L胃蛋白酶)中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)0、3 h后分別取樣，3 h時取1 mL上述培養(yǎng)液加入到9 mL模擬腸液(pH=6.8，1.0 g/L胰蛋白酶、0.3%膽鹽)中，37 ℃ 條件下培養(yǎng) 0、3 h，在0、3 h時分別取樣并采用MRS平板計數(shù)測定活菌總數(shù)。

1.3.7 黏附HT-29細胞能力測定

參考秦雅莉等[14]的方法，將菌株活化好后，離心收集菌體沉淀，用細胞完全培養(yǎng)基(PRMI 1640)培養(yǎng)液將菌體重懸至5×108CFU/mL備用，將傳代5次后的HT-29細胞接種于12孔板中，待細胞長至單層后，加入1 mL供試菌株，培養(yǎng)2 h后，PBS沖洗2次，用300 μL的胰蛋白酶消化3 min，加入700 μL含有10%(體積分數(shù))牛血清的1640培養(yǎng)液終止反應，并將所得溶液收集至無菌EP管中，計數(shù)，同時對空白組的細胞進行計數(shù)。黏附比按照公式(4)進行計算：

(4)

1.3.8 抗生素敏感性測定

在MRS固體平板上涂布200 μL菌體培養(yǎng)液，在每個平板上放置3片抗生素藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h[15]，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3.9 乳酸菌的鑒定

將純化好的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，用試劑盒提取菌體基因組，并用PCR擴增其16S rDNA的基因片段。擴增引物序列為：27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:CRGYTACCTTGTTACGACTT，擴增產(chǎn)物由上海凌恩生物進行測定，測序結果在NCBI中比對分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本試驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均值±標準偏差表示。用Origin繪制圖形，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 鳥苷與肌苷的標準曲線

肌苷在本色譜條件下的保留時間為13.379 min，鳥苷的保留時間為10.105 min。以溶液濃度和峰面積進行線性回歸，肌苷和鳥苷的標準曲線分別為Aino=4.75E7Cino+12 809，R2=1；Agua=4.70E7Cgua-171 597，R2=0.999 8。

2.2 篩選高效降解核苷乳酸菌

對從奶豆腐中分離出的80株乳酸菌的核苷降解能力進行測定，菌株均具有不同程度的核苷降解能力(80株乳酸菌的核苷降解能力結果省略)。表1列出了7株乳酸菌的核苷降解率，菌株的肌苷和鳥苷降解率均在74%以上。菌株NL02和NL07的核苷降解率最強，均在99%以上。本試驗篩選出的菌株NL02、NL07、NL27和NL37對核苷的降解率高于麻菊美[9]篩選出的菌株彎曲乳桿菌5-1，菌株NL46、NL59和NL68對核苷的降解率略低于菌株彎曲乳桿菌5-1。同時可以發(fā)現(xiàn)，菌株對肌苷和鳥苷的降解能力呈正相關，可能是由于鳥苷和肌苷可被同一種酶催化降解，這表明在所測試的菌株中可能含有肌苷或鳥苷的水解酶。肌苷和鳥苷在人體中最終代謝為尿酸，當肌苷和鳥苷攝入量過多時就會導致尿酸水平超標，進而導致疾病發(fā)生。而在微生物和植物中存在尿囊素酶、尿囊酸酶和脲酶，這些酶可以把尿酸分解為對人體無毒性作用的CO2和NH3排除體外。

表1 菌株對肌苷和鳥苷的降解作用Table 1 Degradation of inosine and guanosine by strains

2.3 乳酸菌細胞代謝物對XOD的抑制作用

抑制XOD活性，能有效減少次黃嘌呤形成黃嘌呤并且抑制黃嘌呤形成尿酸，進而減少尿酸生成[10]。乳酸菌細胞代謝物對XOD的抑制作用如圖1所示，隨著樣品添加量的增加，樣品對XOD的抑制率也隨之增加。當添加量最大時，別嘌呤醇對XOD的抑制率為35.31%，菌株NL02、NL07、NL27、NL37和NL46細胞代謝物對XOD的抑制率均在25%以上，而菌株NL59和NL68細胞代謝物對XOD的抑制率較低，分別為12.15%和15.75%。孫瑋[16]研究樺褐孔菌提取物降尿酸功能時發(fā)現(xiàn)，高劑量的水提物(多糖)和醇提物與模型組相比均能顯著降低模型大鼠血清XOD活性。推測本文中乳酸菌的細胞代謝物中可能也含有活性多糖以及其他活性物質(zhì)，可以抑制XOD活性，減少尿酸的生成。

圖1 乳酸菌細胞代謝物對XOD的抑制作用Fig.1 Inhibition of XOD by metabolites of lactic acid bacteria cells

2.4 乳酸菌細胞內(nèi)容物對XOD的抑制作用

乳酸菌細胞內(nèi)容物對XOD的抑制作用如圖2所示，當樣品添加量為250 μL時，細胞內(nèi)容物對XOD抑制作用的總體趨勢為別嘌呤醇>NL02>NL46>NL07>NL37>NL27>NL68>NL59。這與王家彬等[17]研究一致，他發(fā)現(xiàn)短乳桿菌LB1lac20也具有黃嘌呤抑制能力。OOI等[18]研究發(fā)現(xiàn)楊梅素對XOD具有抑制作用，楊梅素被歸類為具有超氧化物清除活性的XOD抑制劑。推測本文中乳酸菌的細胞代謝物和內(nèi)容物均具有一定的抗氧化活性，對超氧化物具有一定的清除能力，所以可以抑制XOD的活性。結合菌株對核苷的降解率、菌株細胞代謝物、菌株內(nèi)容物對XOD的抑制率，優(yōu)選菌株NL02、NL07、NL27、NL37和NL46進行后續(xù)特性分析。

圖2 乳酸菌細胞內(nèi)容物對XOD的抑制作用Fig.2 Inhibition of XOD by lactic acid bacteria cell contents

2.5 酸耐受性

一般情況下人體胃酸pH值為3.0，食物通過胃的時間一般為1～2 h[11]。乳酸菌能夠在人體內(nèi)發(fā)揮生理功能的前提是要耐受酸性條件。菌株在pH為6.2、3.0、2.0 酸性培養(yǎng)基中耐受能力如圖3所示，pH為3.0 的條件對菌株的存活率影響較小，菌株的存活率均在84%以上。但pH為2.0的條件對菌株的存活率影響較大，菌株NL02、NL07、NL27、NL37的存活率在50%以上，顯著高于菌株NL46，說明這4株乳酸菌在此條件下有一定的耐受能力，而菌株NL46的耐受能力較差。這與李堯等[11]的研究結果一致，酸度越低，菌株的耐受性越差。

圖3 菌株酸耐受結果Fig.3 Acid tolerance result of strains注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 膽鹽耐受性

人體正常膽鹽的質(zhì)量濃度為0.3～3 g/L[12]，乳酸菌能夠在腸道中存活、生長和發(fā)揮功效的另一個重要特性是耐受膽鹽。圖4為菌株在未添加膽鹽和膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.3%條件下培養(yǎng)3 h后的存活率，菌株NL02、NL27和NL37在膽鹽質(zhì)量分數(shù)0.3%下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后，存活率在56%以上，顯著高于菌株NL07，說明菌株NL02、NL27和NL37在膽鹽質(zhì)量分數(shù)0.3%下有一定的耐受能力，滿足了在腸道存活的基本要求，而菌株NL07的耐受性較差。這與任大勇等[12]研究結果一致，乳酸菌在有膽鹽存在的培養(yǎng)基中生長，其存活率會下降。

圖4 菌株膽鹽耐受結果Fig.4 Bile salt tolerance result of strains

2.7 胃腸道耐受能力

乳酸菌能到達并存活于消化道是其發(fā)揮益生作用的關鍵。菌株的存活狀況可通過模擬人體胃腸道后的存活率來反映。菌株在人工胃液中的耐受結果如表2所示，菌株NL02、NL27和NL37在人工胃液中的活菌數(shù)都呈現(xiàn)下降趨勢，但所有菌株的活菌數(shù)都達107CFU/mL，存活率皆在52%以上。在人工胃液處理3 h后進入人工腸液，結果如表3所示，菌株NL02和NL27的活菌數(shù)在106CFU/mL以上，存活率也可達到42%以上，而菌株NL37的活菌數(shù)下降到106CFU/mL以下，乳酸菌在胃腸道內(nèi)存活并發(fā)揮作用的活菌數(shù)需達到106CFU/mL以上，所以菌株NL02和NL27可以通過胃在腸道中存活一段時間，從而發(fā)揮其益生功能，而菌株NL37耐人工胃腸液的能力較差。

表2 菌株在人工胃液中的耐受性Table 2 Tolerance of strains in artificial gastric juice

表3 菌株在人工腸液中的耐受性Table 3 Tolerance of strains in artificial intestinal fluid

2.8 黏附HT-29細胞能力

降尿酸乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮良好的生理功能的前提是要能耐受不利于其生存的體內(nèi)環(huán)境(胃酸、膽鹽和胃腸道消化液)。在有一定耐受能力的前提下，還要保證在定植位點具有一定的數(shù)量和增殖能力，才能發(fā)揮益生作用。體外細胞黏附模型可評價乳酸菌的黏附能力[19]。由圖5可知，菌株NL02、NL27和NL37的黏附比分別為(5.56±1.61)、(3.91±1.05)和(1.31±1.34) CFU/cells，菌株NL02和NL27黏附于HT-29細胞的能力顯著高于菌株NL37，菌株NL02黏附力高于秦雅莉等[14]篩選出的發(fā)酵乳桿菌SS-17。說明菌株NL02可以定植于腸道上皮，從而發(fā)揮其益生作用，菌株NL27和NL37黏附于HT-29細胞的能力較差。

圖5 菌株對HT-29細胞的黏附作用Fig.5 Adhesion of strain to HT-29 cells

2.9 抗生素敏感性

目前，抗生素耐藥性是全球公共衛(wèi)生問題，有研究表明乳酸菌可通過食物轉(zhuǎn)移抗生素抗性[20]。因此，在篩選益生菌時，評價其對臨床相關抗生素的耐藥性至關重要。本試驗選用10種抗生素，對菌株NL02進行藥物敏感性測定，根據(jù)CLSI的藥敏試驗標準，對菌株的抗生素敏感性進行判斷。形成的抑菌圈越大，表明菌株對抗生素越敏感。菌株NL02的藥物敏感性結果如表4所示，菌株NL02對四環(huán)素和環(huán)丙沙星呈中度敏感，對其余8種抗生素敏感，說明菌株NL02不具備耐藥性。

表4 菌株抗生素敏感性結果Table 4 Results of antibiotic susceptibility of the strain

2.10 菌株的鑒定

將菌株NL02的16S rDNA測序結果在NCBI中進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)菌株NL02(NMDCN0000Q89)的16S rDNA與Lactobacillusreuteristrain 1509的同源性高達99.93%。采用MEGA 6.0軟件構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6，由此可以判斷菌株NL02屬于羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)。

圖6 基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of isolate and sequences of relating species

3 結論

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的L.reuteriNL02對鳥苷的降解率為100%，對肌苷的降解率為99.32%，其細胞代謝物對XOD的抑制率為31.18%，細胞內(nèi)容物對XOD的抑制率為28.18%，具有較好的潛在降尿酸能力，其降尿酸效果雖然不及合成藥物，但具有低成本和高安全性的特點。L.reuteriNL02耐酸、耐膽鹽、可在人體胃腸道內(nèi)存活，可在人體腸道上皮黏附，并且對10中常見的抗生素不具備耐藥性，對人體健康不存在潛在威脅，具有較好的益生潛力。

開發(fā)具有益生功能的乳酸菌是當前乳酸菌的一大研究趨勢。L.reuteriNL02具有很大的降尿酸和益生潛力，后續(xù)可以進一步研究L.reuteriNL02在細胞和動物實驗中的功效，以得到更直接準確的調(diào)控尿酸能力，并參與到高尿酸血癥的預防和治療中。