新疆沙棘飲料與可樂(lè)對(duì)釉質(zhì)脫礦的體外實(shí)驗(yàn)研究

陳越，吳澤鈺，王靜，羅甜甜，孫新新，劉奕杉*

1(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院) 兒童口腔科，新疆 烏魯木齊，830000)2(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院) 牙體牙髓病科，新疆 烏魯木齊，830000)

酸蝕癥是指酸霧或酸酐作用于牙齒而造成的牙體硬組織的喪失，不涉及微生物[1]。年輕恒牙牙體硬組織礦化程度較成熟恒牙釉質(zhì)低，萌出約2年才能進(jìn)一步礦化，因此在牙齒新萌出2年內(nèi)易發(fā)生脫礦[2]。在中國(guó)北京的179名年輕人中發(fā)現(xiàn)的患病率為46%[3]。有研究得出結(jié)論，酸蝕癥可能影響全球約35%的青少年恒牙[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)碳酸飲料，尤其是碳酸可樂(lè)飲料與酸蝕癥的發(fā)生相關(guān)。幾項(xiàng)體外研究通過(guò)使用不同的參數(shù)評(píng)估了可樂(lè)的脫礦潛力，如pH和緩沖能力、產(chǎn)品與牙齒表面的黏附性、鈣、磷酸鹽和氟化物濃度、牙齒脫礦和磨損；均表明可樂(lè)具有較強(qiáng)的脫礦能力[5-8]。特殊飲食，特別是富含水果和其他酸性食物的飲食，會(huì)增加牙齒侵蝕的風(fēng)險(xiǎn)[9]。一個(gè)國(guó)家內(nèi)的不同地區(qū)在飲食和口味上有不同的偏好，其習(xí)俗和行為也不同，所有這些因素都會(huì)導(dǎo)致酸蝕癥發(fā)生率的變化[9]。新疆地處中國(guó)西北，作為古絲綢之路上的重要一站，獨(dú)特的地理位置及人文環(huán)境[10]，使得新疆沙棘汁在當(dāng)?shù)仡H受歡迎，考慮到兒童及青少年是新疆沙棘汁的主要消費(fèi)者，為了研究沙棘汁對(duì)釉質(zhì)的影響，進(jìn)一步探討沙棘汁與酸蝕癥之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體外將新疆沙棘汁與已知的碳酸飲料(可樂(lè))進(jìn)行比較，探討其脫礦能力，有利于優(yōu)化飲食結(jié)構(gòu)，為預(yù)防酸蝕癥的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

收集新鮮拔除的牛上頜切牙30顆(同齡牛)，保存在0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))百里香酚溶液中，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑和儀器：0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麝香草酚、去離子水、鈣磷離子檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人造唾液(去離子水、NaCl、KCL、Na2SO4、NH4Cl、CaCl2·2H2O、NaH2PO4·2H2O、CN2H4O、NaF)(貨號(hào)：A7990)，北京索萊寶科技有限公司；顯微硬度儀，Zwick(中國(guó))有限公司;激光共聚焦，徠卡測(cè)量?jī)x器(中國(guó))有限公司；掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社。選取市售可口可樂(lè)，中糧可口可樂(lè)飲料新疆有限公司；新疆沙棘汁(新疆惠華沙棘生物科技有限公司)作為實(shí)驗(yàn)溶液，均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 樣本制備

流水下用低速打磨機(jī)以相同方向?qū)⑴Ｇ醒赖难拦谥苽涑? mm×5 mm×2 mm大小釉質(zhì)塊，在蒸餾水中，依次用800、1 200、2 400目的碳化硅砂紙磨平拋光釉質(zhì)面，使用超聲清洗機(jī)蕩洗8 min。牙釉質(zhì)面4 mm×4 mm作為暴露中心，其余部分涂布雙層抗酸指甲油覆蓋。去離子水沖洗后存于0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溴麝香草酚溶液中備用。

1.3 分組及處理

根據(jù)處理溶液的不同分為可樂(lè)組、沙棘汁組、去離子水組，每組10個(gè)樣本。處理步驟如下所示：(1)將樣本放入15 mL離心管，加入處理溶液(10 mL/樣本)進(jìn)行脫礦90 s，每天4次(時(shí)間為10∶00、12∶00、14∶00、16∶00)，脫礦14 d，脫礦過(guò)程中樣本置于恒溫箱中(維持37 ℃以模擬口腔環(huán)境)；(2)去離子水沖洗5 s后，其余時(shí)間浸入人工唾液(pH 6.8，10 mL/樣本)進(jìn)行再礦化，不攪拌(模擬口腔靜息狀態(tài)時(shí))，樣品在人工唾液中放置過(guò)夜，完成24 h的循環(huán)。每天更換1次處理溶液及人工唾液。

1.4 表面硬度測(cè)量

使用顯微維氏硬度儀測(cè)量樣本的硬度。在每個(gè)樣本釉質(zhì)面開窗面測(cè)量5個(gè)點(diǎn)。在飲料脫礦前、脫礦7 d及脫礦后的14 d使用同樣的方法測(cè)定其硬度值。

1.5 pH值及鈣磷離子溶出量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)溶液均在常溫下開瓶，取10 mL使用pH計(jì)測(cè)量各實(shí)驗(yàn)溶液的pH值，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。在脫礦第14天，應(yīng)用磷鉬酸法檢測(cè)處理溶液中的磷離子濃度，鄰甲酚肽絡(luò)合銅法檢測(cè)鈣離子濃度。各取200 μL處理溶液放入96孔板中，每組重復(fù)3次，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算磷鈣離子濃度。

1.6 掃描電鏡觀察

脫礦前和脫礦后每組隨機(jī)各選取2個(gè)樣本，以2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定1 h，用50%、70%、80%、90%及100%(體積分?jǐn)?shù))叔丁醇依次進(jìn)行梯度脫水，每種濃度脫水15 min，隨后掃描電鏡下觀察樣本實(shí)驗(yàn)區(qū)釉質(zhì)表面形態(tài)。

1.7 激光共聚焦觀察

隨機(jī)選取處理后的樣本，制備3～5片300 μm薄片，每組1個(gè)，用羅丹明B溶液避光下放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱染色48 h，觀察脫礦區(qū)熒光滲入情況，分析釉質(zhì)熒光面積(area of the fluorescent lesion，A)、所測(cè)區(qū)域總熒光量(total fluorescent，TF)、所測(cè)區(qū)域平均熒光量(average fluorescent of the lesion，AF)數(shù)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本表面顏色變化

可樂(lè)組和沙棘汁組樣本表面失去光澤，見色素沉著，可樂(lè)組牙面變?yōu)樯钭厣瑥拈_窗面積中心到周邊，顏色逐漸變深；沙棘汁組牙面為棕褐色，在開窗面積中，顏色分布均勻。在去離子水組觀察到牙面變?yōu)榘讏咨?/p>

2.2 表面顯微硬度

如圖1所示，樣本初始硬度值和各組間初始顯微硬度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；脫礦第7天，去離子水組釉質(zhì)塊硬度大于可樂(lè)組，二者均大于新疆沙棘汁組，組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在脫礦第14天，去離子水組硬度值遠(yuǎn)大于可樂(lè)組和新疆沙棘汁組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A-初始硬度值；B-第7天硬度值；C-第14天硬度值圖1 各組樣本表面顯微維氏硬度值Fig.1 T Vickers hardness value of surface of samples in each group注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001(下同)

2.3 三種飲料pH值及鈣、磷離子濃度情況

如表1所示，沙棘組中鈣離子濃度大于可樂(lè)組，二者均大于去離子水組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；可樂(lè)組中磷離子濃度大于新疆沙棘汁組，二者均大于去離子水組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 三種飲料pH值及鈣、磷離子濃度情況Table 1 pH Value and concentration of calcium and phosphorus ions in three beverages

2.4 掃描電鏡觀察結(jié)果

可樂(lè)組釉質(zhì)表面見較密集的小凹陷，部分區(qū)域連接成片，6 000倍下觀察到釉柱不均勻斷裂；去離子水組樣本其表面結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯凹陷，僅見零星小凹陷；新疆沙棘汁組釉質(zhì)呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，表面凹陷面積連接成片(圖2)。

A、B-去離子水組；C、D-可樂(lè)組；E、F-新疆沙棘汁組圖2 各組樣本掃描電鏡圖像Fig.2 Scanning electron microscope images of samples in each group注：A、C、E為3 000倍下圖像；B、D、F為6 000倍下圖像

2.5 激光共聚焦

由表2可知，新疆沙棘汁組A、TF、AF值最大，3組間比較中，新疆沙棘汁組與去離子水組和可樂(lè)組的AF值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且新疆沙棘汁組熒光染料滲透深度連續(xù)均勻；可樂(lè)組熒光染料不連續(xù)，去離子水組中僅見到輕微熒光染料滲入(圖3)；表明新疆沙棘汁脫礦深度強(qiáng)于可樂(lè)組及去離子水組。

表2 各組樣本激光共聚焦參數(shù)結(jié)果Table 2 Confocal laser scanning microscope parameter results for each group of samples

A-去離子水組；B-可樂(lè)組；C-新疆沙棘汁組圖3 各組溶液處理后樣本的激光共聚焦圖像Fig.3 Confocal laser images of samples after treatment with each group of solutions注：A、B、C均為100倍下圖像

3 結(jié)論與討論

楚金普等[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)與人牙具有相似化學(xué)組成的牛牙很適合代替人牙來(lái)檢測(cè)脫礦和再礦化的效果，因此本體外研究以牛牙釉質(zhì)為基質(zhì)，研究了市售可樂(lè)、去離子水和新疆沙棘汁對(duì)牙釉質(zhì)表面的影響。從硬度、鈣磷離子溶出量、釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)及脫礦深度方面評(píng)價(jià)了可樂(lè)、去離子水和新疆沙棘汁對(duì)釉質(zhì)表面的脫礦影響。

關(guān)于表面顯微硬度變化，觀察到隨處理時(shí)間的增加，各組釉質(zhì)塊顯微硬度值均降低，所有測(cè)試飲料均具有脫礦能力，其中新疆沙棘汁組硬度值變化最大，數(shù)值最低，其次為可樂(lè)組。前7 d觀察到最強(qiáng)脫礦效果，在后7 d中的硬度值變化小于前7 d，可以確定釉質(zhì)硬度值的降低與脫礦時(shí)間呈正相關(guān)，脫礦速率由快到慢，持續(xù)脫礦。此外，3組釉質(zhì)的表面顯微硬度損失均增加。此外，口腔環(huán)境復(fù)雜，微生物多樣，實(shí)驗(yàn)所用人工唾液并不能完全模擬口腔微生態(tài)環(huán)境，人工唾液再礦化效果并不明顯，因此觀察到去離子水組具有一定程度的脫礦能力，后期應(yīng)設(shè)計(jì)更為精細(xì)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

釉質(zhì)脫礦涉及棱鏡核prism core(I型脫礦)或棱鏡鞘prisms(Ⅱ型脫礦)，也可以表現(xiàn)出2種類型的脫礦(Ⅲ型脫礦)[17]。最常見的被稱為Ⅰ型脫礦，棱鏡核心材料被優(yōu)先去除，留下棱鏡外圍相對(duì)完整。在Ⅱ型脫礦中，棱鏡的外圍區(qū)域被優(yōu)先去除，留下棱鏡的核心部分相對(duì)不受影響。在Ⅲ型脫礦中，其中一些區(qū)域與Ⅰ型脫礦和Ⅱ型脫礦相對(duì)應(yīng)，同時(shí)還有一些區(qū)域的蝕刻模式不能與棱鏡形態(tài)相關(guān)[18]。釉柱的方向似乎決定了發(fā)生的脫礦模式[18]。掃描電鏡分析顯示新疆沙棘汁組表面出現(xiàn)明顯的變化，表面釉柱斷裂，孔隙率大于可樂(lè)組及去離子水組；在脫礦最深區(qū)域，觀察到釉質(zhì)表面呈鋸齒狀結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域形似火山口，大小不等、形狀不同且部分連接成片，很難分辨正常釉質(zhì)與受累釉質(zhì)之間的邊界；圖2-E、圖2-F可以看出沙棘汁組為Ⅱ型脫礦。相同處理時(shí)間下，可樂(lè)組表面觀察到在脫礦累及處釉柱斷裂，部分區(qū)域呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，部分連接成片，能分清正常釉質(zhì)與受累釉質(zhì)間的邊界，圖2-C、圖2-D中看出可樂(lè)組為Ⅲ型脫礦。去離子水組僅見小面積釉柱斷裂。合理推測(cè)，沙棘汁組脫礦程度強(qiáng)于可樂(lè)組，或許與飲料脫礦類型及牙齒表面存在無(wú)定形無(wú)棱柱釉質(zhì)所致。

進(jìn)行激光共聚焦測(cè)量的目的是評(píng)估熒光染料滲入釉質(zhì)的能力，進(jìn)一步評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)溶液的脫礦能力。表2可以看出新疆沙棘汁組A、TF、AF值最大，3組間比較中，AF差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。新疆沙棘汁引起的釉質(zhì)表面發(fā)生變化，除了與沙棘汁中酸的類型、可滴定酸含量的不同、緩沖能力有關(guān)外；還涉及到新疆沙棘汁的提取工藝，新疆沙棘汁的提純工藝有限[19]，在將沙棘果轉(zhuǎn)為沙棘汁的過(guò)程中，植物纖維與果汁未完全分離，沙棘果汁中存在較多植物纖維，比起市售其他果汁，新疆沙棘汁更濃稠，更易黏附在樣本表面，進(jìn)一步造成牙齒的脫礦。值得注意的是，去離子水組觀察到釉質(zhì)表面硬度降低，溶液中鈣磷離子濃度升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但從掃描電鏡下觀察，其表面結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯凹陷，僅見零星小凹陷。結(jié)果與AMORAS等[20]和REDDY等[21]所得結(jié)果一致。REDDY等[21]調(diào)查了379種市售軟飲料的酸蝕潛力，確定39%具有極強(qiáng)酸蝕性能(pH<3)，54%具有酸蝕性(pH=3～3.99)，僅7%確定為輕微酸蝕性(pH≥4)；普通起泡礦泉水即使其可滴定酸度較低，也具有較低的脫礦能力。眾所周知，唾液的作用可顯著減少因酸蝕而造成的牙齒結(jié)構(gòu)損失，由于獲得性薄膜、動(dòng)態(tài)唾液流動(dòng)和細(xì)菌以及溫度變化的存在，在體外研究中復(fù)制口腔狀況存在一些困難。盡管這項(xiàng)體外研究存在局限性，但提示在以后的研究中需要考慮溫度控制、唾液流量、攪拌等因素。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中3種實(shí)驗(yàn)溶液均具有不同程度脫礦，暴露于實(shí)驗(yàn)溶液的時(shí)間越長(zhǎng)，脫礦愈嚴(yán)重。新疆沙棘汁會(huì)造成嚴(yán)重的牙釉質(zhì)脫礦，新疆沙棘汁脫礦能力強(qiáng)于可樂(lè)，且去離子水也存在脫礦。這提示需要對(duì)家長(zhǎng)進(jìn)行指導(dǎo)，為孩子提供不含過(guò)多酸性產(chǎn)物的飲食，有助于進(jìn)一步優(yōu)化飲食結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果為酸蝕癥的早期診斷和預(yù)防提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。