苯唑西林敏感耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床株耐藥性及生物膜活性分析

溫娟，劉柔杉，張建，王俊瑞

1 內蒙古醫科大學第一臨床醫學院，呼和浩特 010050；2 巴彥淖爾市醫院檢驗科，巴彥淖爾015002；3 內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，呼和浩特 010050；4 內蒙古自治區臨床病原微生物重點實驗室，呼和浩特 010050

金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性球菌，可通過釋放多種毒素引起人和動物的多種感染性疾病，并可形成生物膜導致慢性感染。臨床感染性標本分離的革蘭陽性球菌中，金黃色葡萄球菌始終居于首位[1]。按照其對β～內酰胺類抗菌藥物的耐藥性，金黃色葡萄球菌可分為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin susceptibleStaphylococcus aureus，MSSA） 和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）兩大類，其中MRSA是引起社區及醫院患者感染的一類重要多重耐藥菌，且已被證實可增加住院患者病死率[2]。近年來，有研究報道了一種具有特殊耐藥表型的MRSA亞群，即苯唑西林敏感耐甲氧西林金黃色葡 萄 球 菌（oxacillin～susceptible methicillin～resistantStaphylococcus aureus，OS～MRSA），其在不同國家和地區的檢出率在1.9%～21.4%范圍內，有較大的差異[3～5]。由于常規實驗室檢測方法在篩檢OS～MRSA菌株過程中尚存在一定的技術缺陷，OS～MRSA菌株有可能被錯誤鑒定為MSSA菌株，該結果可使臨床錯誤應用β～內酰胺類抗菌藥物進行治療，延誤抗感染治療時機，甚至導致患者死亡[6]。另有研究表明，與MSSA菌株和MRSA菌株相比，OS～MRSA菌株具有更強的生物膜形成能力[7]，且易受抗菌藥物壓力等因素調控，造成慢性感染[8]。目前我國鮮有人源OS～MRSA菌株的生物膜活性及調控機制的報道?；诖?，本研究對本實驗室2011～2020年期間分離的OS～MRSA菌株的耐藥性、分子分型特征及生物膜活性進行探究，為進一步提高實驗室檢測OS～MRSA菌株的能力、揭示OS～MRSA菌株生物膜形成的分子調控機制、指導臨床合理應用抗菌藥物提供依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2011年1月～2020年12月期間本院臨床常規送檢樣本中分離出的1500株金黃色葡萄球菌菌株，并經微量肉湯稀釋法檢測苯唑西林最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），篩選得到MSSA菌株，～80℃保存備用。

1.2 質控菌株

標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213和金黃色葡萄球菌ATCC43300由本實驗室保存；沙門菌H9812及SCCmec分型所需標準菌株（標準菌株 為 SCCmec I型 NCTC10042、SCCmec II型N315、SCCmec III型 85/2080、SCCmec IV 型JCSC4744、SCCmec V型HS663）分別由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所杜小莉老師和上海市肺科醫院余方友教授饋贈。

1.3 試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB，廣東環凱微生物科技有限公司，批號：1096341）；結晶紫染液（珠海貝索生物技術有限公司，批號：419031）；冰乙酸溶液（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20201106）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20201113）；5×Tris硼酸緩沖液（Tris～Borate～EDTA， TBE，北京索萊寶科技有限公司，批號：20210105）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號：20210922）；瓊脂糖（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：0000938580）；水解酪蛋白肉湯（mueller～hinton broth，MHB，廣東環凱微生物科技有限公司）；水解酪蛋白瓊脂（mueller～hinton agar，MHA，廣東環凱微生物科技有限公司，批號：2846108）；苯唑西林（大連美侖生物技術有限公司，批號：S0501A）；頭孢西丁紙片（英國Oxoid公司，批號：2866348）；細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號：W0130]；2×Taq PCR Mastermix（KT201）[天根生化科技（北京）有限公司，批號：W9608]；溶菌酶（50mg/ml）[天根生化科技（北京）有限公司，批號：X0526]；溶葡萄球菌素（1mg/ml，美國Sigma公司，批號：SLBZ0309）；SeaKem 金瓊脂糖粉（SeaKem gold agarose，SKG，龍沙生物技術有限公司，批號：0000635793）；XbaI內切酶[紐英倫生物技術（北京）有限公司， 批號：10026213]；SmaI限制性內切酶[紐英倫生物技術（北京）有限公司， 批號：0841711]；細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：042021211126）；PCR引物[中美泰和生物技術（北京）有限公司]。

1.4 儀器

ZWY～200D型恒溫培養震蕩搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；Effiency 96型PCR擴增儀（北京領宇科技有限公司）；WD～9413B型凝膠成像分析儀（北京六一生物科技有限公司）；BD～phoenixTM～100system全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（美國BD公司）；microTyper MALDI～TOF質譜儀（江蘇天瑞儀器股份有限公司廈門分公司）；ABI 3730XL 型DNA分析儀（美國應用生物系統公司）；IMH750～S型普通培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XZ21K～7型高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；SUNRISE酶標儀[帝肯（上海）實驗器材有限公司]；CHEF MAPPERTM脈沖場凝膠電泳儀（美國Bio～Rad公司）。

1.5 菌株復核

將～80℃凍存的1500株菌株在血瓊脂平板上傳代復蘇，并在35℃下培養16～18h。采用MALDI～TOF質譜儀和16S rRNA測序技術對菌株進行復核。

1.6 耐藥性檢測

采用微量肉湯稀釋法檢測菌株對苯唑西林的耐藥性。取適量苯唑西林進行倍比稀釋，并轉移至96孔板中備用；將待測菌株培養物配制成0.5MCF的菌懸液，取100μl加入MH肉湯并混勻。吸取定量菌懸液置于含不同濃度苯唑西林的微孔中，使苯唑西林濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03μg/ml。將 96孔板置于35℃培養箱中培養24h，觀察結果并記錄MIC。

采用紙片擴散法檢測菌株對頭孢西丁的耐藥性。取適量0.5MCF菌懸液均勻涂布在MH平板，將頭孢西丁紙片（30μg）貼附于表面，并置于35℃孵箱中培養24h，觀察結果并記錄抑菌圈直徑。

采用BD～phoenixTM全自動微生物鑒定及藥敏分析系統檢測菌株對其他抗菌藥物的敏感性。測試抗菌藥物包括青霉素、紅霉素、四環素、克林霉素、慶大霉素、左氧氟沙星、復方磺胺甲唑、萬古霉素、利奈唑胺和利福平。藥敏試驗結果依據美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的 M100 文件進行判讀[9]。

1.7 mecA基因和mecC基因檢測

對苯唑西林敏感、頭孢西丁耐藥或苯唑西林、頭孢西丁均敏感的菌株進行mecA和mecC基因擴增。基因檢測過程如下：于35℃下培養24h的血瓊脂培養基上，挑取5～10個單菌落溶解于1ml無菌水中，12 000r/min離心2min，棄去上清液，向菌體沉淀中加入溶菌酶（50mg/ml）充分混勻，置于35℃中水浴30min。按照細菌基因組DNA提取盒說明書提取細菌總DNA。PCR反應條件[10～11]為：94℃預變性 4min；94℃變性 30s，50～60℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸4min。引物序列如表1所示。PCR產物進行常規瓊脂糖電泳、成像分析。

表1 mecA、mecC基因的引物序列和片段大小

1.8 分子分型

多位點序列分型（multilocus sequence typing， MLST）基本實驗流程如下。首先依據細菌基因組DNA提取盒說明書提取細菌總DNA。用50μl反應體系進行PCR，包含2μl細菌染色體 DNA、上游引物 2μl、下游引物 2μl、2×Taq PCR Mastermix 25μl以及 ddH2O 19μl。PCR 反應條件[12]為：95℃預變性 5min；95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸5min。對7個持家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL）進行擴增，引物序列如表2所示。PCR產物送中美泰和生物技術（北京）有限公司進行測序，測序反應所用引物與PCR擴增所用引物相同。將測序反應獲得的基因序列與MLST數據庫（http://saureus.mlst.net）進行對比。

表2 MLST分型引物序列和片段大小[12]

葡萄球菌蛋白A分型（staphylococcal protein A typing，Spa typing）。SPA（staphylococcal protein A）是金葡菌細胞壁分離的蛋白，編碼基因包括X域、Fc結合區和C末端3個區域。X基因區呈多態性，含有24bp可變的重復序列，重復序列兩端是相對較保守的區域[13]，自起始序列后的第1個堿基為起始堿基，終止序列前的1個堿基作為終止堿基，以24bp為循環，劃分為2～15個多態性重復序列。Spa采用引物spa～F（5’～TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC～3’）和spa～R（5’～CAGCAGTAGTGCCGTTTGCT～3’）[14]擴增spa基因的可變重復區，PCR產物送中美泰和生物技術（北京）有限公司進行測序，使用Spa分型數據庫（http://spaserver.ridom.de）分析序列。

葡萄球菌染色體盒mec分型（staphylococcal cassette chromosome mec typing，SCCmec typing）。采用多重PCR檢測的方法，設置PCR反應條件[15]為：94℃預變性5min；94℃變性45s，65℃退火45s，72℃延伸1.5min，10個循環；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，25個循環；72℃延伸10min。

脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型。將細菌配制成濃度為3.5～4.0MCF的菌懸液，在37℃下用1mg/ml溶葡萄球菌素消化30min。將預熱的SKG與菌懸液等體積混合并立即注入模具，室溫下靜置直至凝固為膠塊，加入細胞裂解液混合液進行裂解。標準菌株膠塊及實驗菌株膠塊分別置于含XbaI內切酶、SmaI限制性內切酶的緩沖液中孵育。采用脈沖場凝膠電泳儀進行電泳，條帶比對以沙門菌H9812進行標準化。采用BioNumerics V5.1軟件進行膠塊間圖像比較。

1.9 生物膜形成能力測定

將待測菌株經血瓊脂平板傳代培養16～18h后，配制成0.5MCF的菌懸液。用TSB稀釋100倍，移取適量稀釋后溶液置于96孔板中，35℃培養箱孵育24h。將孔中菌液全部吸出、棄去，每孔加入200μl PBS溶液沖洗3次，放置10～20min晾干；每孔加入200μl甲醇，放置20min后吸出、棄去，室溫放置晾干；每孔加入200μl結晶紫溶液，放置5～10min后吸出、棄去；每孔加入200μl PBS溶液沖洗3次，室溫放置直至完全晾干；每孔加入160μl冰乙酸，放置10min，用酶標儀測定620nm處的光密度（optical density，OD）值，平行測定3次。結果判斷標準參照文獻[16]：OD≤臨界 OD 值（cut～off of OD，ODc），表示無生物膜形成；ODc＜OD≤2ODc，表示有弱生物膜形成；2ODc＜OD≤4ODc，表示有中度生物膜形成；OD＞4ODc，表示有強生物膜形成。

1.10 生物膜形成相關基因表達水平檢測

以“1.7”項下所得菌株DNA為模板進行目標基因擴增，檢測基因包括fnbpA、fnbpB、icaA、icaB、icaC、icaD、Bap、clfA和clfB基因，PCR擴增條件[17]為： 94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min。引物信息及靶基因擴增片段見表3。

表3 常見PCR目標基因的引物序列和片段大小

2 結果

2.1 菌株耐藥表型及耐藥基因檢測結果

經mecA和mecC基因檢測確認，共篩選出21株OS～MRSA菌株（1.40%），且均為mecA基因檢測陽性、mecC基因檢測陰性。耐藥性檢測結果表明，21株OS～MRSA菌株均對萬古霉素、利奈唑胺敏感，均對青霉素耐藥；對紅霉素、四環素、克林霉素、慶大霉素、左氧氟沙星、復方磺胺甲唑和利福平的耐藥率分別為76.19%、52.38%、47.62%、23.81%、14.29%、9.51% 和 4.76%。 采用紙片擴散法共篩選出3株頭孢西丁耐藥菌株，分別為 OS～200、OS～1502和 OS～1068，其對應的苯唑西林 MIC值分別為 1、0.5、1μg/ml。21株OS～MRSA株的苯唑西林MIC值及頭孢西丁抑菌圈直徑之間未觀察到明顯相關性。詳見表4。

表4 21株OS-MRSA 菌株的體外藥敏試驗和耐藥性檢測結果

2.2 菌株流行病學特征及分子分型結果

21株OS～MRSA菌株分別分離自創面分泌物（11株，52.38%）、膿液（3株，14.29%）、痰液（3株，14.29%）、血液（2株，9.52%）、支氣管肺泡灌洗液（1株，4.76%）、穿刺液（1株，4.76%）；女性菌株分離率（11株，52.38%）高于男性（10株，47.62%）；兒童菌株分離率（4株，19.05%）低于成人（17株，80.95%）。

21株OS～MRSA菌株的MLST分型、Spa分型結果呈現多樣化特征，見圖1。其中，MLST分型優勢型為ST398型（4株，19.05%）、ST7型（3株，14.29%）；Spa分型優勢型為t571型、t309型和t091型，各優勢型均為2株（9.52%）；SCCmec分型優勢型為SCCmec IV型（11株，52.38%），9株未分型。

圖1 21株OS-MRSA菌株的分子分型結果

2.3 生物膜形成能力

21株OS～MRSA菌株生物膜形成能力如圖2所示。所有菌株均具有生物膜形成能力，其中3株為強產膜株（14.29%），13株為中產膜株（61.90%），5株為弱產膜株（23.81%）。不同菌株產膜能力差異較大，分離自創面分泌物標本的OS～1060、OS～1502菌株產膜能力最強，MLST分型均為ST59型，SCCmec分型均屬IV型，而Spa分型均不同；分離自膿液標本的OS～230菌株產膜能力最弱，MLST分型為ST25型，而SCCmec及Spa方法均未能分型。強產膜株中，2株分離自傷口分泌物標本，1株分離自穿刺液標本；其中2株MLST分型為ST59型，3株Spa分型均不同。中產膜株中，8株分離自傷口分泌物標本，2株分離自血液標本，2株分離自膿液標本，1株分離自痰液標本；3株MLST分型為ST398型，2株Spa分型為t571型。

圖2 21株OS-MRSA菌株生物膜的光密度

2.4 生物膜形成相關基因攜帶情況

PCR結果如表5顯示，不同OS～MRSA菌株生物膜形成相關基因攜帶率差異顯著。21株OS～MRSA菌株（100.00%）均攜帶icaA和icaD基因；16株（76.19%）攜帶fnbpA基因；5株（23.81%）攜帶fnbpB基因；只有1株弱產膜株（OS～228）攜帶Bap基因，且該菌株同時攜帶fnbpA、fnbpB、clfA、clfB、icaA、icaB、icaC和icaD基因；產膜能力最強的3株OS～MRSA菌株（OS～637、OS～1060和 OS～1502株 ） 均 攜 帶clfB、icaA、icaC和icaD基因；產膜能力最強的OS～1502株和產膜能力最弱的OS～230株均攜帶fnbpA、clfA、clfB、icaA、icaB和icaD基因。菌株攜帶上述生物膜相關基因多少與菌株產膜能力強弱之間未顯示出明顯相關性。

表5 21株OS-MRSA菌株生物膜形成相關基因的攜帶情況

3 討論

近年來，OS～MRSA菌株受到了越來越多的關注，包括人源菌株[22～23]及各種動物源菌株[24～26]。國內人源菌株分離率各不相同[4，27]，本研究發現OS～MRSA菌株分離率為1.40%。而MLST分型和Spa分型結果與國內相關文獻不同[28～29]，其中ST398型占比最高（4株，19.04%）；Spa分型結果較為分散，包括t091型（2株，9.52%)、t309型（2株，9.52%)和t571型（2株，9.52%)，而t437型只檢出1株（4.76%）。與賀文強等[3]、Liu等[30]的報道結果相一致，本研究分離OS～MRSA菌株的SCCmec分型主要以IV型為主；結合流行病學數據，提示OS～MRSA菌株主要分離自社區的獲得性感染患者。不同報道中[4，31]OS～MRSA 菌株分子分型的多樣性特征表明OS～MRSA的分布可能更為廣泛且具有地域特征。由于目前報道菌株數量的限制，其實際分布及流行特征尚需進一步探究。Saeed等[32]的研究顯示，在英國7家醫院中，OS～MRSA菌株主要分離自皮膚、軟組織及膿液中，其次是分離自血液，其他類型標本分離率較低。本研究發現21株OS～MRSA菌株主要分離自創面分泌物，少數分離自膿液及痰液，僅2株分離自血液。這表明OS～MRSA更易引起皮膚、軟組織等部位感染，血流感染少見。此外，本研究中4株OS～MRSA菌株分離自1～8歲患兒，分離部位為創面分泌物、膿液、血液及支氣管肺泡灌洗液。由于兒科患者的特殊性，在臨床樣本中出現金黃色葡萄球菌時，應更多關注其耐藥性及抗菌藥物合理使用，避免嚴重感染及并發癥的出現。

目前實驗室檢測MRSA的方法主要為耐藥表型檢測技術，包括苯唑西林稀釋法、頭孢西丁稀釋法或紙片擴散法。研究發現MRSA耐藥機制主要是由于mecA或mecC基因表達青霉素結合蛋白2a（penicillin～binding protein 2a，PBP2a），導致其對幾乎所有β～內酰胺類抗菌藥物產生耐藥性[30]。mecA或mecC基因被認為是確認MRSA的“金標準”[33]，常通過PCR方法進行檢測，但因檢測費用高等因素限制了其在臨床實驗室的廣泛應用。Liu等[30]指出，相較于VITEK～2 AST卡，頭孢西丁紙片擴散法更能準確地識別OS～MRSA，因此被認為是一種可靠且節約成本的鑒別OS～MRSA的方法。同時，17株OS～MRSA的PBP2a乳膠凝集試驗均呈陽性。Becker等[34]發現9株苯唑西林敏感、不產生PBP2a、但mecA基因陽性的臨床分離株。因此，如只使用耐藥表型或只使用基因檢測技術，很可能會造成OS～MRSA的漏診或誤診。為了更準確地識別OS～MRSA，并更好地治療其感染，Liu[30]等指出，對于金黃色葡萄球菌，當苯唑西林MIC在1～2μg/ml時，建議補充頭孢西丁紙片擴散試驗或檢測mecA/PBP2a。對于嚴重金黃色葡萄球菌感染的患者，藥敏試驗檢測為MSSA、使用β～內酰胺類抗菌藥物的療效不理想甚至病情惡化時，應考慮進行mecA基因檢測，特別是對于苯唑西林MIC≥0.5μg/ml的病例。劉柔杉等[35]前期研究發現，OS～MRSA株PBP2a蛋白陽性率僅為42.86%。該結果提示耐藥表型與基因檢測方法聯合應用能最大程度降低OS～MRSA株的漏診率。

細菌生物膜是指細菌在生長過程中附著于非生物或生物表面、由自身產生的胞外聚合物（主要為胞外多糖， 蛋白和胞外DNA） 及其基質網包裹的呈三維結構的菌細胞群體[36]。細菌形成生物膜后其耐藥性增加，而MRSA形成生物膜后會呈現高度耐藥性，并能逃避宿主免疫系統的攻擊，引起嚴重的反復、慢性感染。金黃色葡萄球菌生物膜形成主要為群體感應（quorum sensing，QS）系統的調控，主要包括agr系統及sar系統[36]。sarA基因可影響細胞間多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）的產生。PIA主要由ica基因編碼產物形成，在生物膜形成過程中具有重要作用[37]。胡曉豐等[36]提出icaADBC基因簇的表達可促進PIA的合成。在本研究中，21株OS～MRSA均攜帶icaA和icaD基因，可能在OS～MRSA菌株生物膜形成中發揮主要作用。部分菌株（如OS～230和OS～1068株）僅攜帶icaA、icaB、icaD基因，而不攜帶icaC基因。但某些ica突變的菌株也可形成生物膜[38]，因此 Archer等[39]指出，除PIA依賴的生物膜形成機制之外，還存在非PIA依賴的生物膜形成機制，主要通過細胞外基質蛋白（如SPA、Bap等）發揮作用。本研究中，OS～228株是唯一一株攜帶Bap基因的菌株，同時攜帶fnbpA、fnbpB、clfA、clfB、icaA、icaB、icaC和icaD基因，但呈現弱產膜能力。因此，生物膜形成能力的調控機制仍有待進一步探究。MRSA生物膜形成主要通過fnbB基因介導， 而sarA調控子可能通過調節fnbB基因的表達促進MRSA生物膜的形成[36，40]。Brahma 等[41]也發現，在其研究的所有OS～MRSA分離株中，fnbA和fnbB基因表達水平呈上調趨勢。但在本研究中，fnbB基因陽性率僅為23.81%，fnbB基因在本研究收集OS～MRSA菌株生物膜形成能力中的作用可能是有限的。目前關于clfA和clfB基因是否參與OS～MRSA生物膜的形成還沒有相關報道，本研究中clfA、clfB基因的陽性率分別為90.48%和95.24%，clfA、clfB基因在本組菌株中廣泛存在，其是否為調控生物膜形成能力的重要因素還需要進一步研究。綜上所述，不同OS～MRSA菌株間生物膜形成能力差異顯著，調控機制可能存在菌株異質性特點，對于高產膜菌株及其生物膜形成機制應該進一步探究。

另外，金黃色葡萄球菌生物膜形成能力受多種因素影響，特別是抗菌藥物的抑菌作用。朱科等[42]研究發現，亞抑菌濃度頭孢洛林對MRSA菌株的生物膜形成具有顯著誘導作用，提示亞抑菌濃度頭孢洛林可能引起MRSA菌株胞外多糖的產生和上調icaA基因的表達，從而導致細菌生物膜形成能力增強。He等[7]使用頭孢他啶誘導OS～MRSA形成生物膜，證明β～內酰胺類抗菌藥物可誘導OS～MRSA形成生物膜。在頭孢他啶作用下，膜囊泡（membrane vesicles，MVs） 是 OS～MRSA形成生物膜的重要結構成份，而對照組OS～MRSA生物膜中MVs含量很少。此外，在頭孢他啶作用下，OS～MRSA菌株的clfA、clfB表達量顯著下降，提示PIA在頭孢他啶調控OS～MRSA的生物膜形成過程中可能不起關鍵作用，也表明亞抑菌濃度β～內酰胺類抗菌藥物對OS～MRSA生物膜形成調控機制的普遍性和多樣性。鑒于本研究大部分OS～MRSA菌株為中或強產膜菌株，亞抑菌濃度β～內酰胺類抗菌藥物對OS～MRSA生物膜形成能力的影響、機制及菌株間的異質性值得進一步研究。

綜上所述，人源OS～MRSA株整體分離率較低，但實驗室常用耐藥表型方法容易導致苯唑西林MIC較低的OS～MRSA株的漏檢，進而導致嚴重后果。耐藥表型方法及基因檢測技術聯合應用能最大程度提高OS～MRSA株的檢出率。本研究分離的21株OS～MRSA均具有產膜能力，且不同菌株間產膜能力及生物膜形成相關基因表達差異顯著。OS～MRSA高產生物膜能力及生物膜形成能力的異質性及機制仍需進一步探究。