同位素內(nèi)標(biāo)-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定小麥和玉米中19種真菌毒素

何卓霖，李子琨，穆 蕾，謝云峰，王 亮

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1，烏魯木齊 830046) (北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部2，北京 100124) (中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院；營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3 ，北京 102209)

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在一定條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，能夠引發(fā)人和動(dòng)物產(chǎn)生各種急性或慢性疾病[1-4]。世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)將單端孢霉烯族類毒素、伏馬類毒素、赭曲霉類毒素、黃曲霉類毒素等列為造成食源性疾病的根源之一[5,6]。糧食及其制品在生產(chǎn)、加工和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中均有可能受到多種真菌毒素污染[8,9]。據(jù)調(diào)查，我國(guó)小麥和玉米易受脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏馬毒素(FB)等的污染；朱群英等[10]利用液質(zhì)聯(lián)用同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定204份小麥粉樣品中7種真菌毒素，其中DON檢出率達(dá)90%，超標(biāo)率為41%，ZEN檢出率為68.6%，超標(biāo)率為2.9%；譚莉等[11]利用基質(zhì)分散固相萃取凈化(QuEChERS)技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定240份玉米樣品中的9種真菌毒素，DON及其衍生物檢出率為30.4%～52.9%，F(xiàn)B檢出率達(dá)85.8%～96.7%；任貝貝等[12]對(duì)河北省的74份玉米、玉米制品以及240份小麥樣品中16種真菌毒素污染水平進(jìn)行調(diào)查分析，F(xiàn)B、ZEN和DON為主要污染物。我國(guó)高度重視真菌毒素污染問(wèn)題，頒布了食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)[13]，對(duì)小麥和玉米中黃曲霉毒素B1 、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的含量作了限定，但是尚未明確規(guī)定伏馬毒素、T-2毒素和HT-2毒素等毒素限量值。開(kāi)發(fā)快速、精準(zhǔn)、高通量的真菌毒素檢測(cè)方法對(duì)于加強(qiáng)糧食毒素污染監(jiān)測(cè)能力，提升糧食質(zhì)量安全保障水平，具有重要意義。

目前，常用的真菌毒素檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[14,15]、高效液相色譜法(HPLC)[16-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS )[20,21]等。其中ELISA具有方法簡(jiǎn)單、樣品處理時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，多用于單一真菌毒素的快速檢測(cè)，但重復(fù)性較差且易受到基質(zhì)的干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性[14]。HPLC法常結(jié)合熒光或紫外檢測(cè)器，多用于檢測(cè)單一或者同一類化學(xué)性質(zhì)相近的同類真菌毒素，但受限于定性能力不足，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多組分真菌毒素同時(shí)快速測(cè)定[16-18]。LC-MS/MS法具有強(qiáng)大的定性、定量分析能力，適用于多種類真菌毒素同時(shí)檢測(cè)；其特有的選擇性離子監(jiān)測(cè)技術(shù)，極大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，使得樣品可以采用更為簡(jiǎn)單、快速的預(yù)處理[19-22]，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)定量方法能夠校正質(zhì)譜離子化過(guò)程存在的基質(zhì)效應(yīng)，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[23,24]。

本研究針對(duì)常規(guī)真菌毒素繁冗復(fù)雜的前處理程序，簡(jiǎn)化樣品提取凈化方法, 并利用同位素內(nèi)標(biāo)校正樣品基質(zhì)干擾，建立LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定小麥和玉米中常見(jiàn)19種真菌毒素方法，為糧食中真菌毒素精準(zhǔn)檢測(cè)、污染監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LC-30AD高效液相色譜儀，QTRAP 5500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，Allegra 64R臺(tái)式高速離心機(jī)，TTL-DCⅡ型氮吹儀，Mili Q超純水機(jī)，Dragon Lab QL902渦旋振蕩器，SB-3200DTDN 超聲波清洗器。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；甲酸(98%)；超純水，Mili Q純水機(jī)制得；黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2)；嘔吐毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON)；T-2毒素(T-2)；HT-2毒素(HT-2)；伏馬毒素B1(FB1)；伏馬毒素B2 (FB2)；伏馬毒素B3 (FB3)；赭曲霉毒素A(OTA)；赭曲霉毒素B (OTB)；雜色曲霉毒素(STC)；玉米赤霉烯酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(玉米赤霉酮(ZAN)、赤霉烯酮(ZEN)、α-赤霉醇(α-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)；13C黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液(U-[13C17]-AFTB1、U-[13C17]-AFTB2、U-[13C17]-AFTG1、U-[13C17]-AFTG2)；13C伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液(U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2)；U-[13C34]-FB3；U-[13C17]-3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)；U-[13C15]-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)；U-[13C17]-15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；U-[13C18]-玉米赤霉烯酮(ZEN)；U-[13C22]-HT-2毒素；U-[13C20]-赭曲霉毒素A(OTA)；U-[13C24]-T-2毒素(T-2)；U-[13C24-STC]；U-[D4-α-ZEL]

1.3 方法

1.3.1 19種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取一定體積的19種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水(80∶20)溶液定容，配制成19種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后于-20 ℃以下冰箱內(nèi)避光保存，質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。

表1 19種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度

1.3.2 16種真菌毒素穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取一定體積的16種真菌毒素同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水(80∶20)溶液定容，充分混勻后于-20 ℃以下冰箱內(nèi)避光保存，質(zhì)量濃度見(jiàn)表2。由于ZAN、α-ZAL、OTB 3種毒素?zé)o市售商品化內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，因此分別選擇與其結(jié)構(gòu)類似、出峰相鄰的ZEN、α-ZEL、OTA對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)13C18-ZEN、D4-α-ZEL、13C20-OTA進(jìn)行定量。

表2 16種真菌毒素穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合工作液質(zhì)量濃度

1.3.3 真菌毒素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的配制

準(zhǔn)確吸取2、4、6、8、20、40、80 μL真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，均加入10 μL同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液稀釋成體積為200 μL的19種真菌毒素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。

1.3.4 樣品前處理

取玉米試樣，高速粉碎機(jī)粉碎，混勻，準(zhǔn)確稱取2 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入50 μL的內(nèi)標(biāo)混合工作液，加入10 mL乙腈∶水∶甲酸 (80∶18∶2)溶液提取，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min，在4 ℃下8 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈離心管中，渦旋混勻1 min，取5 mL在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液復(fù)溶，渦旋震振1 min，超聲5 min，12 000 r/min離心10 min，取上層清液待測(cè)。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Shiseido-C18(100 mm×2.0 mm×3 μm)，進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL/min；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸/水溶液，B相為甲醇溶液，梯度洗脫條件如表3所示。

表3 梯度洗脫程序

1.3.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度：550 ℃；離子噴霧電壓：5 500 V(正模式)/-4 500 V(負(fù)模式)；氣簾氣：35 psi；氣體1∶50 psi；氣體2∶55 psi；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 質(zhì)譜條件參數(shù)

續(xù)表4

2 結(jié)果與討論

2.1 真菌毒素的分離優(yōu)化

本研究通過(guò)優(yōu)化液相流動(dòng)相洗脫梯度、質(zhì)譜離子源參數(shù)以及各真菌毒素的碎裂能和去簇電壓，以期獲得最優(yōu)的分離效率和檢測(cè)靈敏，結(jié)合19種真菌毒素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異，分別使用正、負(fù)離子模式采集，MRM色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 13種真菌毒素混標(biāo)的正模式MRM色譜圖

圖2 6種真菌毒素混標(biāo)的負(fù)模式MRM色譜圖

2.2 前處理方法優(yōu)化

為有效避免糧食基質(zhì)對(duì)真菌毒素提取效率的影響，綜合考慮19種真菌毒素的極性差異，分別使用不同有機(jī)相比例的提取液進(jìn)行提取。以玉米基質(zhì)為例，分別考察使用10 mL乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液和10 mL乙腈∶甲酸=98∶2提取液提取，本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用乙腈∶水 (98∶2) 進(jìn)行提取時(shí)，提取液中高比例的有機(jī)溶劑會(huì)大量溶出基質(zhì)中的雜質(zhì)，造成方法靈敏度降低；其次，大部分毒素的回收率也無(wú)法滿足要求。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，使用乙腈∶水∶甲酸(80∶18∶2) 提取液時(shí)，非極性較大的毒素如黃曲霉毒素、鐮刀菌屬毒素、赭曲霉毒素等均有較好的提取效率，同時(shí)，各真菌毒素的回收率均在60%～120%之間，綜合考慮，選取乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液可實(shí)現(xiàn)19種真菌毒素的統(tǒng)一前處理并保證各毒素目標(biāo)物回收率均滿足要求。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品中的內(nèi)源性組分以及樣品處理過(guò)程中引入的雜質(zhì)造成的，在電噴霧離子化模式下，各類真菌毒素的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度均易受到基質(zhì)干擾[25,26]，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線和空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來(lái)判斷基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。基質(zhì)效應(yīng)按公式計(jì)算:C= ( 1-Ss/Sm) ×100%；式中：C為基質(zhì)效應(yīng)；Ss為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率，Sm為空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。|C| 在20% 以下為較弱基質(zhì)效應(yīng)，在20%～50%之間為中等基質(zhì)效應(yīng)，50%～100%為之間強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[27]。小麥和玉米的基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素、嘔吐毒素和伏馬毒素都具有強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，其余的少數(shù)真菌毒素屬于較弱基質(zhì)效應(yīng)。因此，在所有樣品和標(biāo)品中均加入穩(wěn)定同位素，利用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，從而彌補(bǔ)真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)，保證質(zhì)譜結(jié)果的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

表5 小麥和玉米的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以目標(biāo)分析物面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)、相應(yīng)目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比和10倍信噪比時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物峰面積計(jì)算濃度，確定方法對(duì)于各目標(biāo)物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果如表6所示。在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)19種真菌毒素色譜峰面積與質(zhì)量濃度成良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2大于0.992，檢出限(LOD)為0.04～10.00 μg/kg，定量限(LOQ)為0.12～30 μg/kg。

表6 線性方程和檢出限、定量限

2.4.2 回收率和精密度

取空白樣品，分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算6次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表7。本方法回收率和精密度結(jié)果良好，回收率在61%～117%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15%，符合GB/T 27404—2008的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求[28]，方法具有良好的準(zhǔn)確和精密度，適用于糧食中19種真菌毒素的日常檢測(cè)。

表7 回收率和精密度結(jié)果(n=6)

續(xù)表7

2.4.3 質(zhì)控樣品的考察

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和適用性，使用建立的檢測(cè)方法對(duì)FAPAS能力測(cè)試樣品玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(TCL0406QC)進(jìn)行檢測(cè)。如表8所示，10種真菌毒素的檢測(cè)值均在范圍內(nèi)，且接近標(biāo)示值，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法準(zhǔn)確可靠。

表8 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)玉米中各真菌毒素檢測(cè)結(jié)果

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用建立的方法，對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的14份小麥和14份玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表6所示。玉米主要受到嘔吐毒素、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮的污染，其中嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的檢出率均為86%；我國(guó)真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017對(duì)谷物及其制品中DON和ZEN的限量為1 000、60μg/kg[12]，而樣品中DON和ZEN的含量為1 870.25、266.75 μg/kg，嚴(yán)重超過(guò)國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，超標(biāo)率均為43%；而小麥中主要污染的毒素為15-AC-DON、DON、FB1，小麥中各真菌毒素均未超過(guò)國(guó)家限量。為確保糧食質(zhì)量安全，在糧食種植和生產(chǎn)的過(guò)程中進(jìn)行真菌毒素的監(jiān)測(cè)十分有必要。

表9 小麥、玉米實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)定量，建立了小麥和玉米中19種真菌毒素的精準(zhǔn)檢測(cè)方法。該方法靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單、分析速度快。經(jīng)驗(yàn)證，準(zhǔn)確度和精密度滿足方法學(xué)要求，方法定量限遠(yuǎn)低于我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)小麥和玉米中真菌毒素最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，適用于批量糧食樣品中多種類真菌毒素殘留污染的快速篩查和精準(zhǔn)定量檢測(cè)。