基于網絡藥理學探討槲皮素治療肺癌的分子作用機制

吳程，謝李華，鄭晨華，林任璽，林偉彬，張曉艷

肺癌(lung cancer,LC)是全球癌癥相關死亡的主要原因，每年約有200萬例確診病例[1]。LC主要分為小細胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)，其中SCLC約占15%，NSCLC約占85%[2]。現階段治療LC的主要方法包括手術、化療、放射治療、靶向治療和免疫治療等。然而這些治療方法不僅費用昂貴，且長期療效差、副作用明顯[3]，存在易復發、不良反應明顯等問題，LC患者的5 a生存率僅為4%～17%[4-8]。因此，繼續探索有效的LC治療策略，尋找與研發更有效的藥物至關重要。

天然產物在治療癌癥方面具有毒性低、副作用少的優勢，目前已有許多從天然產品中提取出來的化合物被批準用于臨床[9]。槲皮素是一種天然的膳食生物黃酮類化合物，廣泛存在于自然界和人們的日常飲食中，主要來源包括蔬菜(洋蔥、蕎麥、甘藍、西紅柿等)、水果(葡萄、櫻桃、蘋果、芒果、柑橘等)、綠茶和紅酒等[10-11]。研究[12-15]表明，槲皮素具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗細胞凋亡、抗增殖活性和抗腫瘤等。近年來已有研究[16-19]報道，槲皮素能夠抑制LC細胞的增殖和生長、促進LC細胞凋亡及抑制LC細胞的侵襲和轉移。然而，槲皮素對LC的潛在作用靶點及分子作用機制仍有待進一步深入探討。

網絡藥理學是一門集高通量組學數據分析、虛擬計算機分析和網絡數據庫檢索于一體的系統生物學和多向藥理學相結合的學科，通過構建“成分—靶點—通路—疾病”網絡，系統、多方位地闡明藥物成分與疾病的靶點之間的相互作用關系及潛在的分子作用機制，對研究藥物的作用機制和新藥創新研發均具有重要的意義[20-21]。本研究擬采用網絡藥理學方法預測槲皮素治療LC的潛在作用靶點及信號通路，旨在揭示槲皮素在治療LC的分子作用機制，進而為臨床研究、應用和新藥研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 槲皮素相關作用靶點信息的獲取及篩選 TCMSP(http://tcmspw.com/)是一個系統藥理學平臺，包含有關中草藥的信息，如成分、靶點、相關疾病和ADME屬性等[22]，以“quercetin”作為關鍵詞，口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似度 (drug-likeness,DL)≥0.18作為篩選依據，進行潛在作用靶點預測[23-24]。根據pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫，以“quercetin”作為關鍵詞，獲取槲皮素的Canonical SMILES，下載其2D結構，保存為sdf格式；將其2D-sdf格式導入SwissTargetPrediction數據庫，進行潛在靶點預測。對TCMSP和SwissTargetPrediction兩個數據庫的槲皮素相關作用靶點進行合并，剔除重復值，得到槲皮素的相關作用靶點信息。利用UniProt(https://www.uniprot.org)數據庫對相關作用靶點基因名稱進行標準化處理，留下經過“審查”且屬于“人類”的基因以便進一步分析。

1.2 LC相關靶點信息的獲取及篩選 以“lung cancer”作為關鍵詞，從GeneCards(http://www.meetGeneCards.org)數據庫[25]獲取LC的相關靶點，并篩選出“relevance score”≥20的靶點[26]。同時，以“lung cancer”作為關鍵詞，在OMIM(https://omim.org/)數據庫[27]的“Gene Map”中獲取LC的相關作用靶點。對兩個數據庫的靶點信息進行合并，剔除重復值，得到LC相關靶點信息。

1.3 槲皮素治療LC潛在作用靶點的獲取及PPI網絡建立 使用Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線軟件，對槲皮素和LC的相關靶點信息進行交集分析，交集部分表示槲皮素治療LC的潛在作用靶點。將兩者的共同靶點導入STRING(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl)數據庫[28]中建立PPI網絡，物種設置為“homo sapiens”，選擇具有高置信度(high:>0.7)，其余的參數保持為默認設置，以獲取相互作用關系信息表。

1.4 槲皮素治療LC潛在核心靶點的篩選 將String數據庫中槲皮素治療LC的相關靶點PPI網絡數據導出為TSV格式文件，再導入到Cystoscape 3.7.2軟件中進行PPI網絡的可視化分析。Degree和Betweenness能夠衡量一個節點在網絡拓撲結構中的重要程度和關鍵性，值越高說明節點在PPI網絡中的拓撲地位越重要；Closeness反映在網絡中某一節點與其他節點之間的接近程度，值越大，表明該節點與其他節點的距離越接近[29]。篩選出“Degree”“Closeness”和“Betweenness”這3個指標均大于中位數的靶點，即為槲皮素治療LC的潛在核心靶點。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)的富集分析 將槲皮素治療LC的潛在靶點導入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫中進行富集分析，得到GO生物學過程和KEGG信號通路富集分析。以P<0.001作為篩選條件，并依據富集通路涉及基因數的數量，從大到小進行排名，篩選出GO富集分析中排名前10的通路以及KEGG富集分析中排名前20的通路。將分析得到的數據上傳至微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)，結果以氣泡圖的形式呈現。

1.6 “成分—靶點—通路”網絡構建 基于獲得的槲皮素治療LC的潛在靶點及DAVID數據庫富集分析得到槲皮素治療LC的潛在信號通路，用Cytoscape 3.7.2軟件建立槲皮素治療LC的“成分—靶點—通路”網絡圖。

2 結 果

2.1 槲皮素成藥性檢驗及其作用靶點 在TCMSP數據庫中得到槲皮素的ADME參數，如MW=302.25，OB(%)=46.43，DL=0.28等。OB是一種衡量口服藥物運輸到全身循環和藥物作用部位的能力的指標，OB>30%的化合物被認為具有有效的吸收能力。DL是根據化學成分的生化和物理性質來研究其藥效的指標，可獲得藥物的平均藥物相似度為0.18，因此在網絡藥理學分析中，藥物相似性高于這一平均值的化合物被認為具有藥物潛力。根據TCMSP查詢結果可知，槲皮素具有潛在的藥物性質。在Pubchem數據庫中，得到槲皮素的結構式(圖1)，其Canonical SMILES結構式為C1=CC(=C(C=C1C2=C(C(=O)C3=C(C=C(C=C3O2)O)O)O)O)O，將其2D-sdf格式導入SwissTargetPrediction數據庫中，獲得100個槲皮素的靶點。在TCMSP數據庫中得到槲皮素相關作用靶點并經Uniprot數據庫標準化處理后，共有靶點143個；合并2個數據庫并剔除重復值后，得到槲皮素的相關作用靶點共226個。

圖1 槲皮素結構式Fig.1 Quercetin structural formula

2.2 LC相關靶點及槲皮素治療LC潛在靶點的收集 從GeneCards數據庫中篩選出816個LC相關靶點，OMIM數據庫篩選出65個LC相關靶點，合并2個數據庫并剔除重復靶點后，得到861個LC相關靶點。使用Venn在線軟件將槲皮素作用靶點與LC疾病靶點相映射，篩選出槲皮素可能作用于LC的潛在靶點101個(圖2)。將篩選出來的101個潛在靶點導入到Cytoscape 3.7.2軟件中，構建活性成分—潛在靶點網絡圖(圖3)。

圖2 槲皮素治療肺癌靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of target protein for the treatment of lung cancer by quercetin

2.3 潛在靶點PPI網絡的構建與分析 將槲皮素治療LC的101個潛在靶點蛋白輸入STRING數據庫中，選擇高置信度PPI(high confidence:score>0.7，hide disconnected nodes in the network)，構建得到1個包括101個節點和791條邊的靶蛋白相互作用PPI網絡(圖4)。將101個共同作用靶點的PPI網絡獲得的“string_interactions.tsv”文件導入到Cytoscape 3.7.2軟件進行Network Analysis分析，其中“Degree”“Closeness”和“Betweenness”的中位數分別為15.663、0.005和115.228，靶點篩選條件為“3個指標均大于中位數”，獲得23個槲皮素治療LC潛在的核心靶點，包括TP53、AKT1、EGFR、CASP3、VEGFA、SRC、TNF、IL6、MAPK1、MYC、MMP9、IL1B、CCND1、PTEN、RELA、PIK3R1、HIF1α、ERBB2、CAV1、NFKBIα、AR、MMP2、PTGS2(表1)。

：藥物以及疾病；：靶點基因。圖3 槲皮素和肺癌共同作用靶點圖Fig.3 Co-action target map of quercetin and lung cancer

圓節點代表蛋白靶點，圓圈大小和顏色深淺代表靶點蛋白相互作用的緊密程度，圓圈越大表明靶點蛋白的緊密程度越高。圖4 槲皮素治療肺癌潛在靶點相互作用網絡Fig.4 Interaction network of potential targets for lung cancer treatment with quercetin

表1 槲皮素治療肺癌潛在核心蛋白靶點信息Tab.1 Information on potential core protein targets for lung cancer treatment with quercetin

2.4 GO功能富集分析 運用DAVID數據庫對槲皮素治療LC的潛在靶點進行GO功能富集分析，通過設定P<0.001的指標并根據富集基因數的數量，從大到小進行排序，篩選出排名前10項(圖5～7)。GO富集功能分析顯示涉及695個生物過程(biological process,BP)，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控、細胞因子介導的信號通路、信號傳導、基因表達的正調控等；64個細胞組分(cellular component,CC)，包括細胞核、細胞質、細胞溶質、胞外間隙、外泌體、線粒體等；121個分子功能(molecular function,MF)，包括蛋白質結合、ATP結合、酶結合、蛋白激酶結合等。

2.5 KEGG功能富集分析 將槲皮素治療LC的潛在靶點導入到DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析，共得到156條通路，以P<0.001作為篩選條件并且根據富集基因數的數量，由大到小進行排序，篩選出排名前20的通路(圖8)。這些潛在靶點主要富集在脂質和動脈粥樣硬化、肝細胞癌、前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、麻疹等多種疾病之中，并參與了不同的信號通路，包括：癌癥相關通路、PI3K-AKT信號通路、細胞衰老、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、MAPK信號通路以及microRNAs參與對LC的調控等。

2.6 “成分—靶點—通路”網絡的構建 基于獲得的槲皮素治療LC的潛在靶點及DAVID數據庫富集分析得到的槲皮素治療LC潛在信號通路，用Cytoscape 3.7.2軟件建立槲皮素治療LC的“成分—靶點—通路”網絡圖(圖9)，網絡圖包含105個節點，624條邊線，槲皮素治療LC與TP53、AKT1、EGFR、CASP3、VEGFA等84個靶標有關，與PI3K-AKT、MAPK等信號通路以及microRNAs參與對LC的調控。

3 討 論

槲皮素是一種存在于天然產物中具有良好生物活性的植物化學物質，其在多種疾病的預防和治療方面發揮著重要作用。槲皮素對LC的潛在作用靶點及分子作用機制仍有待進一步深入探討。網絡藥理學以系統生物學理論為基礎，整合了藥理學、高通量測序、基因組學等技術，強調信號通路的多通道調控。本研究通過網絡藥理學方法建立了槲皮素、靶點、通路和LC之間的關聯，以探討槲皮素在LC中的分子作用機制。

縱坐標表示生物過程，橫坐標表示富集因子，Rich Factor越大表明富集程度越大，氣泡顏色由綠變紅表示調整后的P值越小，氣泡越大表明富集到生物過程上的基因數越多。圖5 槲皮素治療肺癌潛在靶點的生物過程分析Fig.5 Biological process analysis of potential targets for lung cancer treatment with quercetin

縱坐標表示細胞組分，橫坐標表示富集因子，Rich Factor越大表明富集程度越大，氣泡顏色由綠變紅表示調整后的P值越小，氣泡越大表明富集到細胞組分上的基因數越多。圖6 槲皮素治療肺癌潛在靶點的細胞組分分析Fig.6 Cellular component analysis of potential targets for lung cancer treatment with quercetin

縱坐標表示分子功能，橫坐標表示富集因子，Rich Factor越大表明富集程度越大，氣泡顏色由綠變紅表示調整后的P值越小，氣泡越大表明富集到分子功能上的基因數越多。圖7 槲皮素治療肺癌潛在靶點的分子功能分析Fig.7 Molecular function analysis of potential targets for lung cancer treatment with quercetin

縱坐標表示信號通路，橫坐標表示富集因子，Rich Factor越大表明富集程度越大，氣泡顏色由綠變紅表示調整后的P值越小，氣泡越大表明富集到該信號通路上的基因數越多。KEGG:京都基因與基因組百科全書。圖8 槲皮素治療肺癌潛在靶點的KEGG信號通路富集分析Fig.8 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of potential targets for lung cancer treatment with quercetin

：藥物；：靶點基因；：信號通路。圖9 槲皮素治療肺癌的“成分—靶點—通路”圖Fig.9 “Component-target-pathway”diagram of lung cancer treatment with quercetin

基于網絡藥理學，將獲得的101個槲皮素和LC的共同靶點進行PPI核心網絡分析，篩選出23個核心靶點。其中排名前5的核心靶點分別為TP53、AKT1、EGFR、CASP3和VEGFA。

將槲皮素治療LC的潛在靶點進行KEGG通路富集分析，得到與LC密切相關的PI3K-AKT、MAPK信號通路及microRNAs對LC的調控。

PI3K-AKT信號通路是細胞內最重要的信號通路之一，它能夠調節細胞的生存、生長、分化、代謝和細胞骨架重組[47]。大多數癌蛋白和腫瘤抑制因子參與細胞代謝/信號傳導調節，它們在PI3K/AKT信號通路中以一種平衡狀態會聚，這種平衡在幾種人類癌癥中通過激活和失活機制而改變[48]。趙純等[49]的研究表明，槲皮素與順鉑聯用能夠通過PI3K/AKT信號通路抑制LC細胞A549/DDP增殖，誘導A549/DDP細胞的凋亡。MAPK級聯是細胞內廣泛存在的絲-蘇氨酸蛋白激酶超家族，是將細胞表面的信號轉入細胞核內并引起相應變化的重要傳導通路。MAPK信號通路在惡性腫瘤細胞增殖、分化、遷移和耐藥發展中起著至關重要的作用，該信號通路主要包含四大途徑：細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated protein kinases,ERK)途徑，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)途徑、大絲裂素活化蛋白激酶1(big MAP kinase 1,BMK1)途徑及p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)途徑[50]。ZHU等[51]的研究表明，槲皮素通過改變LC細胞中Bcl-2家族蛋白的表達，激活MEK/ERK信號通路，抑制有絲分裂激酶Aurora B的活性，發揮抗肺癌作用。microRNAs是一類小的非編碼RNA，它們是基因表達的主要調控因子，調控特異性癌基因、腫瘤抑制因子、腫瘤干細胞和腫瘤轉移，是腫瘤的發生、發展過程中一個重要的生物標志物[52]。現有的研究[16,53-54]表明，microRNAs參與了LC的發病機制：槲皮素通過上調miRNA-16的表達抑制緊密連接蛋白Claudin-2的表達水平，進而降低A549細胞的增殖和遷移；過表達miRNA-134 能夠抑制EGFR相關信號通路，通過誘導細胞周期阻滯或凋亡進而抑制NSCLC細胞的增殖；槲皮素通過上調miRNA-34a-5p的表達抑制NSCLC細胞的生存、增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過網絡藥理方法探討槲皮素治療LC的潛在分子作用機制，確定槲皮素治療LC的關鍵靶點、主要生物學過程和主要信號通路，為其進一步的臨床研究、臨床應用和新藥研發提供理論依據。但由于本研究僅是基于數據的挖掘和分析，槲皮素治療LC的分子作用機制仍需通過后期的基礎實驗和臨床研究進行驗證。