乳腺乳頭狀腫瘤冰凍切片誤診和延遲診斷的回顧性分析

劉蕓，黃智勇，鄒宗楷

1891年，冰凍切片(冰凍)診斷被首次嘗試用于乳腺腫瘤的術中定性[1]，并隨著技術的進步，逐漸成為可信賴的術中診斷方法。目前，國外由于乳腺細針穿刺活檢和空芯針穿刺活檢的廣泛應用，術中送檢乳腺病變組織要求定性的病例已明顯減少；但國內乳腺病變的定性仍主要依靠術中冰凍。乳腺乳頭狀腫瘤是包括一系列從良性病變到惡性病變的疾病譜系，是業內公認的診斷難點，尤其在術中冰凍診斷時。本研究通過收集乳腺乳頭狀腫瘤的冰凍病例，統計其冰凍確診符合率及延遲診斷率，并比較良惡性病變冰凍誤診及延遲診斷的差異，歸納其形態學特點，探討冰凍誤診及延遲診斷的主要原因或診斷陷阱，總結診斷線索、提出應對措施，以期提高該類腫瘤冰凍確診符合率，降低誤診率、延遲診斷率，為外科醫生制定手術方案提供更精確的依據。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2017年4月11日—2021年 1月8日漳州市醫院病理科石蠟及冰凍均診斷為乳腺乳頭狀腫瘤、且冰凍以此為主要病變的病例273例，均為女性，年齡中位數47歲(22～83歲)。

1.2 方法 術中送檢的乳腺組織均經過肉眼仔細觀察并詳細記錄；根據病變大小酌情取材1～2塊組織塊，應用德國萊卡CM1950恒溫冷凍切片機進行冰凍切片，而后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,H-E)染色。冰凍切片均由兩位病理醫師在收到組織后30 min內完成診斷。冰凍剩余組織和再取組織經10%中性福爾馬林固定液固定，石蠟包埋、制片、H-E染色，并挑選合適蠟塊，使用羅氏全自動免疫組織化學(組化)染色儀[BenchMark ULTRA/ISH Staining Module]進行免疫組化染色；顯微鏡下觀察H-E切片的組織學形態及免疫組化染色表達情況。

1.3 判斷標準 根據腫瘤國際分類編碼，將導管內乳頭狀瘤、導管內乳頭狀瘤伴導管上皮普通型增生(usual ductal hyperplasia,UDH)、導管內乳頭狀瘤伴導管上皮不典型增生(atypical ductal hyperplasia,ADH)歸入良性病變，將導管內乳頭狀瘤伴導管內癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、導管內乳頭狀癌(intraductal papillary carcinoma,IPC)、包裹性乳頭狀癌(encapsulated papillary carcinoma,EPC)、實性乳頭狀癌(solid papillary carcinoma,SPC)、原位癌伴微浸潤、原位癌伴浸潤性癌歸入惡性病變。

查閱所有病歷資料并重新閱讀所有切片，根據冰凍診斷結果對手術方式的影響[2]，以石蠟診斷作為金標準，將冰凍與石蠟診斷結果進行對照分析，評價指標如下。(1)確診。冰凍與石蠟診斷完全符合或基本符合，完全符合指兩種診斷方式在腫瘤性質、類型結果方面完全相同，基本符合指兩種診斷方式的腫瘤性質結果相同，類型有所區別。確診符合率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數。(2)誤診。包括假陰性與假陽性，假陰性指石蠟診斷為惡性病變而冰凍診斷為良性病變。假陽性指石蠟診斷為良性病變而冰凍診斷為惡性病變。(3)延遲診斷。冰凍未能明確診斷，需等待石蠟診斷結果。

假陰性率=n假陰性/(n假陰性+n真陽性)×100%

假陽性率=n假陽性/(n假陽性+n真陰性)×100%

延遲診斷率=n延遲診斷/n總×100%

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，良惡性病變的確診符合率及延遲診斷率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 冰凍診斷結果的各項評價指標情況 273例中，冰凍確診242例(88.6%)，延遲診斷21例(7.7%)；其中石蠟診斷良性病變226例，冰凍確診221例(97.8%)，假陽性1例(0.5%)，延遲診斷4例(1.8%)；石蠟診斷惡性病變47例，冰凍確診21例(44.7%)，假陰性9例(33.3%)，延遲診斷17例(36.2%)。

2.2 良惡性病變冰凍的確診符合率和延遲診斷率比較 惡性病變冰凍的確診符合率(44.7%)明顯低于良性病變(97.8%)，前者的延遲診斷率(36.2%)明顯高于后者(1.8%)，兩者比較，差別有統計學意義(P<0.05)。

2.3 冰凍誤診及延遲診斷病例的分布情況 石蠟診斷為導管內乳頭狀瘤伴低級別DCIS病例中，1例冰凍誤診為導管內乳頭狀瘤伴UDH，3例延遲診斷。導管內乳頭狀瘤伴中級別DCIS病例中，2例冰凍誤診為導管內乳頭狀瘤伴UDH，3例延遲診斷。IPC病例中，3例冰凍誤診為導管內乳頭狀瘤伴UDH或伴ADH，2例延遲診斷。EPC病例中，1例冰凍誤診為導管內乳頭狀瘤伴UDH，2例延遲診斷。原位SPC病例中，6例延遲診斷。SPC伴浸潤病例中，2例冰凍誤診為導管內乳頭狀瘤伴ADH，1例延遲診斷。導管內乳頭狀瘤伴ADH或伴UDH病例中，1例冰凍誤診為導管內乳頭狀腫瘤，灶性間質浸潤，4例冰凍延遲診斷，其中1例延遲診斷病例懷疑間質浸潤。

2.4 冰凍誤診及延遲診斷病例的形態學特點

2.4.1 惡性病變 導管內乳頭狀瘤伴DCIS以及IPC、EPC共有6例冰凍低診斷為導管內乳頭狀瘤伴UDH或伴ADH。其中1例石蠟診斷導管內乳頭狀瘤伴中級別DCIS，冰凍中見較多典型的菊形團樣結構、僵硬的拱橋結構，細胞核仁較明顯，可見少量小瘤巨細胞(圖1A)。共有10例冰凍延遲診斷，1例石蠟診斷IPC，冰凍診斷為未除IPC，冰凍中見分枝狀乳頭結構，乳頭寬窄不一，但間質疏松、沒有明顯膠原化，乳頭軸心周圍細胞呈假復層或復層化排列，細胞具有單一性(圖1B)。1例石蠟診斷EPC，冰凍診斷為未除EPC，冰凍中見大量菊形團樣結構，細胞單一，有厚纖維包囊。其余8例冰凍均診斷為導管內乳頭狀瘤伴ADH，未除更重病變。除上述3例外，其余病例冰凍中部分可見典型ADH區域，但病灶小或分散(圖1C)；部分病例在ADH區域仍可見較多量纖維血管軸心；部分病例ADH區域不典型，缺乏典型結構或細胞特點，4例在周圍普通導管內出現ADH或DCIS。原位SPC共有6例冰凍診斷為未除SPC，冰凍中均見結節輪廓圓滑，結節內細胞以實性增生為主，纖維血管軸心周圍細胞呈柵欄狀排列，實性區域出現數量不等的菊形團樣結構，4例細胞核偏位、呈漿細胞樣，1例纖維血管軸心間質內見大量黏液，1例局灶可見細胞呈流水樣排列，細胞核長橢圓形(圖1D、E)。共有3例SPC伴浸潤冰凍低診斷或延遲診斷，冰凍中均見結節內細胞以實性增生為主，結節內有細胞外黏液，細胞核偏位、呈漿細胞樣，部分區域結節輪廓不規則，呈地圖樣、鋸齒狀，2例可見細胞內黏液，1例可見小灶黏液癌成分(圖1F、G)。

2.4.2 良性病變 2例導管內乳頭狀瘤伴UDH，冰凍中見導管周圍膠原間質及乳頭軸心膠原間質中，導管上皮細胞呈腺樣、簇狀、條索狀排列(圖1H)，1例腺體周圍肌上皮在H-E染色下看不清，冰凍誤診為腫瘤浸潤周圍間質，1例部分腺體周圍隱約可見一層不完整的扁平肌上皮，冰凍懷疑間質浸潤，請上級醫師會診后，診斷為未除間質浸潤。此2例石蠟經免疫組化染色證實為假浸潤現象。導管內乳頭狀瘤伴ADH或伴UDH有3例冰凍診斷為導管內乳頭狀瘤伴ADH，未除更重病變。前者冰凍中見大量膠原化纖維血管軸心，軸心之間可見少量典型ADH區域；后者冰凍中未見典型ADH區域，可見多少不等大汗腺化生。

3 討 論

乳腺乳頭狀腫瘤是包括一系列從良性病變到惡性病變的疾病譜系，WHO對于該類腫瘤各個類型的診斷主要依賴于H-E染色切片中的組織學形態及免疫組化染色結果。而冰凍診斷時往往缺乏免疫組化染色，主要根據在H-E染色下對組織學形態的觀察與判斷。

A：中高級別細胞核( ×200)；B：分枝狀乳頭結構，間質疏松，上皮細胞假復層排列( ×40)；C：菊形團樣結構( ×100)；D：實性、菊形團樣結構( ×100)；E：細胞核偏位，呈漿細胞樣( ×200)；F：結節輪廓不規則，呈地圖樣、鋸齒狀( ×40)；G：黏液癌區域( ×40)；H：假浸潤腺體與右側的良性病變相延續( ×40)。圖1 乳腺乳頭狀腫瘤冰凍切片中的形態學特點(H-E染色)Fig.1 Morphology characteristic of papillary breast tumors on frozen section tissues (H-E staining)

本研究發現，乳腺惡性乳頭狀腫瘤較良性乳頭狀腫瘤更易出現誤診或延遲診斷，與國內報道[3-4]相似。

目前，導管內乳頭狀瘤伴ADH和伴低級別DCIS以3 mm作為分界線[5-6]，以防將很小的低級別病變診斷為DCIS，并且避免這些微小的病變被過度治療[7-8]。本研究中，導管內乳頭狀瘤伴DCIS以及IPC、EPC病例誤診或延遲診斷，部分是由于典型ADH區域小或分散，或ADH區域可見較多纖維血管軸心，或ADH區域結構或細胞不典型。日常工作中掌握ADH的典型形態特點是正確識別ADH及測量其范圍的前提條件；當ADH區域纖維血管軸心沒有明顯減少，H-E染色下不易判斷軸心內肌上皮存在與否及多寡的情況下，不輕易診斷為導管內乳頭狀瘤伴低級別DCIS；當典型ADH病灶分散，連續病灶最大徑位于臨界值附近時，直接診斷導管內乳頭狀瘤伴低級別DCIS存在一定風險，建議延遲診斷。當ADH形態不典型，不可勉強診斷，待石蠟進行免疫組化染色進一步證實。

本研究中，4例導管內乳頭狀瘤伴DCIS在周圍導管內出現ADH/DCIS，其中3例病變穿插生長，但連續的ADH區域均大致為3 mm，為避免判斷偏差導致過度治療，選擇延遲診斷。1例乳頭狀病變延遲診斷，但周圍導管診斷了DCIS，使得該患者避免了二次手術。AGOUMI等[9]指出，導管內乳頭狀瘤伴ADH/DCIS可能是一種“碰撞”腫瘤，即終末導管小葉單位發生的ADH/DCIS延伸到導管內乳頭狀瘤中。筆者認為，導管內乳頭狀瘤內外同時出現ADH/DCIS，如果兩者穿插生長，可以合并測量及診斷，如果截然分開，則分開測量并分別診斷。有研究[6,10]表明，導管內乳頭狀瘤外的ADH/DCIS與繼發癌癥風險及局部復發風險關系更加密切。所以，周圍導管的病變需要診斷，并且在冰凍診斷時，一定程度上可以協助診斷。

導管內乳頭狀瘤伴中高級別DCIS，DCIS區域沒有大小或范圍的限制，只要核級達到，即可診斷[11-12]。因此，識別出中高級別細胞核很重要。高級別核異型明顯，相對容易識別；中級別核介于高、低之間，形態存在一定交叉，鑒別存在一定主觀性，可重復性差。筆者認為，如果細胞核級偏向高級別，冰凍診斷時無需區分中或高級別，因為不影響良惡性的診斷。本研究中1例誤診病例未能識別出核級別偏高及典型DCIS結構，導致低診斷。如果細胞核級偏向低級別，為避免主觀偏差，按照導管內乳頭狀瘤伴低級別DCIS的標準進行診斷可能更穩妥。

本研究中，1例IPC冰凍診斷為未除IPC，形態學屬于Ⅰ型IPC。根據定義，要求90%以上乳頭軸心完全缺乏肌上皮層[13]，但在H-E染色下對肌上皮的判斷不甚可靠。國內外學者[14-16]總結了IPC和導管內乳頭狀瘤在形態上的區別，關于乳頭軸的寬度尚存在爭議。所以，不能僅僅根據乳頭軸的寬度區別二者。Ⅰ型IPC在低倍鏡下常呈“藍色”，細胞形態一致，而導管內乳頭狀瘤在低倍鏡下常呈“粉紅色”，細胞較不一致，常伴有大汗腺化生[15]。本研究中的病例在低倍鏡下病灶呈“藍色”，乳頭軸的寬度并非均為纖細，但都沒有明顯的膠原化，細胞具有單一性，這些特點可能具有一定的提示意義。Ⅱ型IPC如果部分區域ADH的形態不夠典型，容易被診斷為導管內乳頭狀瘤伴ADH/低級別DCIS[13]。本研究中，共有8例IPC以Ⅱ型為主，4例冰凍診斷為原位癌病變，其中僅1例為IPC。筆者認為，冰凍診斷時病變的良惡性判斷最重要。同為原位癌病變，目前臨床處理基本相同，類型判斷有所偏差尚可接受。

EPC周圍常有厚薄不一的纖維包囊，囊內的乳頭狀病變可以出現IPC的任何形態，細胞往往為低中核級[17]。本研究中，7例EPC均為低中核級，纖維包囊厚薄不一(4例厚而明顯)，4例冰凍診斷為原位癌病變，僅有1例懷疑EPC但延遲診斷。EPC的提出是基于結節內外肌上皮的基本消失[18-19]，而H-E染色下不能準確判斷肌上皮，加上纖維包囊厚薄不一，故冰凍診斷時直接診斷EPC存在困難。目前，EPC被認為可能介于原位癌與浸潤性癌之間，但是建議外科仍按照原位癌處理[18-19]。當細胞呈現高核級，才建議按照浸潤性癌處理[20]。所以，除非出現高核級，EPC在冰凍診斷時只要診斷為原位癌病變即可。

原位SPC結節輪廓圓滑，結節內細胞以實性排列為主，細胞往往為低級別核，有時細胞呈梭形、流水樣排列[17]，容易與導管內乳頭狀瘤伴旺熾性UDH混淆。本研究發現，僅有原位SPC成分時，出現較多延遲診斷。纖維血管軸心周圍細胞呈柵欄狀排列，實性區出現菊形團樣結構，細胞形態單一，細胞核偏位，呈漿細胞樣、印戒細胞樣，出現細胞內外黏液，對診斷原位SPC有提示意義。而導管內乳頭狀瘤伴旺熾性UDH常伴有大汗腺化生[15]，基本不出現細胞內外黏液。SPC結節輪廓不圓滑、呈地圖樣、鋸齒狀[17]，對診斷浸潤性SPC有提示意義。當SPC呈浸潤性生長模式或出現浸潤性癌成分時，冰凍確診符合率較高，但仍存在低診斷病例。3例誤診或延遲診斷病例，雖然病變中黏液豐富，導致組織較破碎，影響觀察，但細胞外出現較多黏液，具有提示診斷意義。

冰凍診斷時最嚴重的情況莫過于假陽性病例導致外科過度治療，而導管內乳頭狀瘤最容易出現假陽性的情況莫過于假浸潤現象。導管內乳頭狀瘤經常伴發導管周圍間質或纖維血管軸心間質硬化性改變，擠壓內陷的腺體，導致這些腺體排列紊亂，呈條索狀、簇狀排列，肌上皮被擠壓，在H-E染色下有時不容易識別。缺乏冰凍診斷經驗的醫生易將其誤診為浸潤性癌。本研究中有2例冰凍時診斷誤判。如何避免誤判？首先，這些假浸潤腺體伴隨的導管內乳頭狀病變多為良性，這些腺體常與主病灶存在一定的延續，兩者細胞形態相似，缺乏不典型性或異型性。其次，周圍的間質多為膠原組織，罕見浸潤引起的促纖維結締組織。再次，高倍鏡下仔細尋找腺體周圍肌上皮，有時可見不連續的扁平肌上皮。日常冰凍診斷中，當進一步診斷存在疑點，都應該退一步診斷，避免過診。

乳腺乳頭狀病變中UDH和ADH的鑒別不僅關系到其本身的鑒別，還關系到多種惡性乳頭狀腫瘤的診斷。平時需加強對冰凍中ADH形態的甄別。建議可將冰凍剩余組織進行免疫組化染色，評估對ADH的判斷是否準確。倘若在術中冰凍診斷時引入快速免疫組化染色，一方面通過CK5/6、P63等標記肌上皮，另一方面通過CK5/6標記腺上皮協助判斷ADH的范圍，應該能夠改善冰凍確診符合率。宋欣等[3]通過比較常規冰凍診斷及結合快速免疫組化再次給出術中診斷發現，后者的術中診斷準確率顯著高于前者，假陰性率和延遲診斷率顯著低于前者；并且快速免疫組化染色流程耗時約 10 min，符合診斷時限要求。

綜上所述，冰凍中乳腺惡性乳頭狀腫瘤的確診符合率明顯低于良性乳頭狀腫瘤，前者的延遲診斷率明顯高于后者。導管內乳頭狀瘤可以出現假浸潤現象，冰凍診斷時需提高警惕，并注意與真性浸潤進行鑒別。導管內乳頭狀瘤伴DCIS以及IPC、EPC的低診斷，主要是因為對ADH形態的識別及范圍的評估出現偏差，需加強對冰凍中ADH形態的識別能力。當ADH范圍較小(略超過3 mm時)建議暫時保守診斷，待石蠟切片進行免疫組化染色進一步明確其范圍。診斷乳腺乳頭狀腫瘤時需注意識別病變中的中高級別細胞核，因為中高級別DCIS的診斷沒有范圍限制。對乳腺乳頭狀腫瘤各個類型形態學特征的掌握，可以在冰凍診斷時提供更多的診斷思路；按原位癌處理的多種乳頭狀腫瘤類型，在冰凍診斷時能夠識別出原位癌病變即可，不必強求精準診斷。乳頭狀腫瘤良惡性的判斷出現偏差，還有部分原因是H-E染色下對肌上皮的判斷不夠可靠以及ADH形態不夠典型，引入快速免疫組化染色可能有助于更好地識別腺上皮的不典型性及肌上皮的存在與否及多寡。在缺乏免疫組化染色的情況下，當進一步診斷存在疑點，應當退一步診斷，以免過診。