基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統及其在感染性疾病分子診斷中的應用

方楓玲(綜述)，郭紹彬，傅亞，林曹瑞，劉燦，歐啟水(審校)

感染性疾病嚴重威脅人類健康，也是臨床工作的主要難題之一。分子診斷是感染性疾病診斷的重要部分。臨床上常用的分子診斷方法為聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，但其對儀器、場地、人員的專業性要求限制了它在感染性疾病診斷中的應用。近年來，RNA調節系統被開發應用于分子診斷的研究日益增多[1-2]。立足開關(toehold switch)屬于RNA核糖調控元件，它通過與目標RNA序列的堿基互補配對來控制基因表達[3]。2014年，哈佛大學GREEN團隊[4]成功設計了立足開關，使其與無細胞轉錄翻譯(cell-free transcription-translation，TX-TL)系統相結合，開創了分子診斷新的領域，成功實現了多種病毒性感染疾病相關病原體(如埃博拉病毒和寨卡病毒)的分子診斷[5-6]。

隨著立足開關性能的提高，人們還將基于立足開關的體外無細胞轉錄翻譯系統與紙基平臺相結合，實現分子診斷的即時檢驗(point-of-care testing，POCT)[5-10]。隨著立足開關技術的不斷發展和完善，該技術必將給感染性疾病的現場快速診斷帶來重大變革。

1 基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統

立足開關是一類基于RNA的從頭設計的可編程原核生物核糖調控元件，其通過與任意序列的同源RNA相互作用進而誘導下游基因的表達。立足開關具有寬的動態范圍、正交性和可編程性，通過聯合無細胞轉錄翻譯系統，可作為一種分子診斷方法應用于多種病原體的檢測[4]。

1.1 立足開關的基本結構 傳統的核糖調控系統通過自身RNA序列在核糖體結合位點(ribosome binding site，RBS)區域形成堿基互補配對來阻止核糖體結合，從而抑制基因的翻譯。當與觸發RNA(trigger RNA)結合時，RBS序列釋放，啟動基因的翻譯。但是，由于抑制基因翻譯是通過RBS序列結合實現的，因此觸發RNA就必須含有RBS的序列，才能將抑制序列替換出來[4,11]。

GREEN團隊[4]提出一種解決方案，即設計立足開關，其可以結合和感知任意特定的RNA序列。立足開關是一個 RNA發夾結構。發夾結構5’末端的單鏈區域稱為立足序列，可與觸發RNA互補配對。開關包含受調控基因的編碼序列，該編碼序列的上游是基于發夾結構的信息處理模塊，包含RBS和起始密碼子，二者分別排列在一個環和一個凸起中，其后緊接一個具有21個核苷酸的連接序列(圖1)。

RBS：核糖體結合位點；AUG：起始密碼子。圖1 立足開關結構示意圖Fig.1 Schematic view of the design of the toehold switch

與傳統的核糖調控元件不同，立足開關通過在發夾環中隔離起始密碼子(AUG)和RBS來阻斷下游基因翻譯，這個特性使立足序列不受限制，可設計任意的立足序列，用于不同病原體的分子診斷[4]。通過合理設計立足開關，使其結合任意特定的觸發RNA序列，激活蛋白翻譯，這不僅大大提高了序列的正交性，降低了串擾，而且觸發RNA可靶向任意RNA序列的特性，顯著拓展了立足開關的應用范圍。

1.2 立足開關的設計原則 基于合成生物學的分子診斷系統通常由3個部分組成：傳感器模塊、信號處理器模塊和報告模塊[12]。對于立足開關而言，立足區域是傳感器模塊，中間的莖環結構是信號處理模塊，下游的特定蛋白編碼基因是報告模塊。立足區域和報告基因可以根據所檢測的病原體需求合理調整，并可以整合為更高復雜性的系統組件[5]。

設計立足開關應參照以下原則：(1)立足開關本身應形成一個穩定的發夾環結構，隔離RBS和起始密碼子，避免在沒有觸發RNA存在的情況下激活下游基因表達而造成信號泄露；(2)與單獨存在的立足開關和觸發RNA相比，立足開關-觸發RNA復合體應有一個更穩定的能量狀態，通過相互作用促進發夾環結構的展開和下游基因的激活；(3)立足開關序列中不能包含禁止下游基因翻譯的終止密碼子；(4)立足開關識別的觸發RNA序列應是這個立足開關RNA特有的，以防止脫靶效應[13]。

1.3 立足開關的作用機制 當僅有立足開關存在時，其發夾結構將RBS與起始密碼子AUG隔離，阻斷下游編碼基因翻譯；當觸發RNA(病原體RNA)存在時，其與開關的立足區域結合，通過線性-線性雜交相互作用[14]，啟動 RNA-RNA鏈置換相互作用，打開發夾結構，釋放RBS，從而激活基因并啟始翻譯[4]。通過將受調控的基因設計為報告基因，如GFP和lacZ基因，就可以可視化檢測目標觸發RNA分子的存在，這就是立足開關系統的分子診斷基礎。

立足開關解決了傳統核糖調控元件的設計局限性，具有寬動態范圍、高正交性和高度可編程性。通過引入線性-線性雜交相互作用，而不是環-環或者環-線性作用，使得立足開關在動力學和熱力學上比傳統的核糖調控元件更有優勢[4]。可以針對特定的病原體任意設計立足開關的立足序列，這種高靈活性有利于立足開關在分子診斷中的應用[15]。

1.4 無細胞轉錄翻譯系統 無細胞轉錄翻譯系統可以在體外控制平臺上模擬體內細胞轉錄翻譯的環境，從而在生物體外對生物系統進行原型設計和工程改造[16]。近年來，無細胞轉錄翻譯系統為體外蛋白質表達以及 DNA調控元件、基因回路和代謝途徑的原型設計提供了一個快速而有力的平臺[17]。

無細胞轉錄翻譯系統包含了體外基因表達所需的所有必要成分：(1)細胞提取物。主要通過細胞裂解并去除細胞碎片獲得，包含核糖體、RNA聚合酶和其他從源菌株提取的轉錄翻譯過程必需的蛋白質(如σ因子、起始因子和延伸因子)。(2)反應混合液。主要是蛋白合成的補充輔因子，包括氨基酸、核苷酸、鹽、多胺和能量物質、擁擠試劑(如聚乙二醇或Ficoll)、代謝輔因子、緩沖液、轉運 RNA(transfer RNA，tRNA)和其他代謝添加劑(例如谷胱甘肽)。(3)DNA模板。質粒或者線性表達模板(linear expression template，LET)。將3種成分混合并在16～37 ℃下孵育，體外DNA表達模板即可在細胞提取物和反應混合液的共同作用下，轉錄生成 mRNA，隨后翻譯成蛋白質，此過程通常需要1～24 h[18]。通過運用冷凍干燥技術，將配置好的無細胞轉錄翻譯體系和基因模板分別固定在紙基或其他多孔材料上，在室溫下可以長期儲存長達1 a[9]，易于運輸攜帶。當二者混合并加水活化，基因模板便會在體系中表達，合成蛋白質[6]。

無細胞轉錄翻譯系統的優勢：(1)可大規模生產，成本低廉；(2)可使用環狀或易獲取的PCR線性DNA模板；可靈活利用各種輔助組分優化反應體系；(3)體系可做成干粉狀，易于儲存和攜帶[6,19]。這些優勢使無細胞轉錄翻譯系統為核酸分子診斷平臺提供一個強有力的技術支撐，大大提高了分子診斷技術的靈活性和便攜性。目前，無細胞轉錄翻譯系統已經應用于一些分子診斷領域，如寨卡病毒和呼吸道合胞病毒的分子診斷[1-2,5,10]。

1.5 基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統的工作原理 研究表明，立足開關常常在無細胞轉錄翻譯系統中開發[5-6,8-9,20-21]。立足開關具有可以結合任意特定的RNA分子的能力，無細胞轉錄翻譯系統具有在體外合成蛋白的能力，二者相結合，具有開發成分子診斷工具的潛力。將編碼立足開關RNA的質粒DNA模板與無細胞轉錄翻譯系統共同冷凍干燥至紙基上，加水活化后，質粒作為模板，在無細胞轉錄成分作用下，轉錄生成立足開關RNA。立足開關中的RBS被隔離，下游的報告基因處于抑制狀態，在靶核酸存在的情況下，立足開關RNA與靶RNA互補配對，RBS被釋放，激活下游的報告基因，在無細胞翻譯成分的作用下，報告基因在體外翻譯表達，通過聯合不同的檢測平臺如熒光、比色和電化學等輸出[4-6,22]，在滿足不同系統的要求下，便可以直觀地檢測報告基因的表達(圖2)。根據以上工作原理，該系統已被開發應用于感染性疾病的分子診斷。

RBS：核糖體結合位點；AUG：起始密碼子。圖2 立足開關工作原理圖Fig.2 Schematic view of the operating principle of the toehold switch

2 基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統在感染性疾病分子診斷中的應用

根據基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統作為分子診斷工具的工作原理，該系統已被開發成分子診斷技術，用于診斷多種感染性病原體，如埃博拉病毒、寨卡病毒和諾如病毒等[5-6,21]，為感染性疾病的快速便攜診斷提供了新的契機。

2014年，埃博拉疫情在西非爆發。PARDEE團隊[6]開發了一種將無細胞基因合成網絡嵌入到紙張的便攜式低成本的診斷方法，通過將針對埃博拉病毒的立足開關傳感器和無細胞轉錄翻譯體系冷凍干燥在紙基上來快速檢測埃博拉病毒。此開關僅需60～120 min 即可檢測到埃博拉病毒RNA。另一方面，紙基傳感器制造成本低廉，將其引入檢測系統，使操作簡單方便，可直接肉眼觀察檢測結果。

2015年，PARDEE團隊[5]在無細胞紙基平臺上開發了基于立足開關的RNA傳感器，用于檢測寨卡病毒。同時引入了一種可以與凍干傳感器平臺兼容的提供單堿基識別的檢測方法，即NASBA-CRISPR裂解法(NASBA-CRISPR Cleavage，NASBACC)，利用依賴核酸序列的擴增技術(nuclear acid sequence-based amplification，NASBA)的高效等溫擴增和CRISPR/Cas9的序列特異性核酸酶活性來快速區分寨卡病毒的美洲譜系和非洲譜系。此外，該系統只需將病毒樣品煮沸2 min，通過NASBA 擴增3 h，30 min便可以檢測到獼猴血漿中病毒載量低至2.8×10-15mol/L的寨卡病毒。通過結合等溫RNA擴增和凍干紙基平臺，不僅提高了便攜性，還降低了成本，該技術的檢測試劑成本遠低于目前臨床核酸檢測常用的實時熒光定量PCR技術(quantitative real-time PCR，qPCR)，解決了基于核酸的分子診斷技術應用的局限性。以上這些優勢使這項診斷技術以低廉的價格在資源匱乏地區的實施成為可能。

2018年，該團隊在之前研究的基礎上構建了新的方法，該方法可以在 3～5 h內特異性檢測人類腸道微生物組中的10種細菌。通過結合NASBA，可以半定量檢測艱難梭菌毒素的mRNA水平，因此可以快速區分艱難梭菌攜帶狀態和艱難梭菌感染性腹瀉[8]。同年，MA團隊開發了另一種基于立足開關的無細胞轉錄翻譯檢測系統，可以從人類糞便標本中檢測諾如病毒 GII.4型 Sydney流行株[21]，在此基礎上結合同源體的病毒富集和磁珠，將結合磁珠的檢測限降低到2.7×10-19mol/L(靈敏度提高1 000倍)。2021年，PARK團隊將逆轉錄環介導等溫擴增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)結合到立足開關系統中，全程 70 min即可完成檢測，檢測限為120拷貝數/反應，達到了臨床檢測新型冠狀病毒樣本所需的靈敏度[7,23]。最近，國內的CAO和SUN團隊基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統，開發出多項可通過肉眼查看紙基顯色、判斷是否感染呼吸道合胞病毒以及區分其亞型的分子診斷技術[10,20]。

這些應用證明了基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統在感染性疾病的分子診斷方面具有巨大潛力。相比臨床上常用的qPCR技術，基于立足開關聯合無細胞轉錄翻譯系統的分子診斷平臺，不僅表現出同樣的特異度和靈敏度，而且不需要專門的檢測儀器、專業的技術人員以及試劑的冷鏈運輸條件，更加便攜、快速、低成本[5-8,10,21]，還能開發為試紙用于POCT，這些優勢更加貼合感染性疾病診斷的要求。

3 總結與展望

目前，基于立足開關的無細胞轉錄翻譯平臺作為一種新興的分子診斷技術，以便攜、低成本、快速及高靈敏度等優勢取得了較大進展，但該診斷技術也存在一些局限性，如立足開關的信號泄露，可能導致假陽性結果的產生；檢測平臺無法實現完全定量。當前相關研究成果僅在實驗室規模的環境中呈現，如果要將這種技術從實驗室引入臨床，并提供有效的診斷能力，還需要完善立足開關的設計、測試大規模樣本，以及通過多學科整合對其效率和穩定性進行綜合性評估。

目前，人們正在研究計算方法，以改進立足開關的設計方案和性能[24]，通過多學科聯合發展，不斷地將新興技術與該技術聯合實現優勢互補，以促進該診斷系統在臨床實踐中的應用。隨著技術的發展，基于立足開關的無細胞轉錄翻譯系統將使得針對臨床常見感染性病原體，如生殖道感染病原體、呼吸道感染病原體等的快速檢測成為可能，有利于我國POCT分子診斷的開發和應用，促進公共衛生事業的發展。