一株高效氯嘧磺隆降解菌的分離鑒定及其降解機理初探

韓曉艷，阮志勇，江 旭，周義清，張慶華

（1．江西農業大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045；2．中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；3．西藏農牧學院資源與環境學院，西藏 林芝 860000）

氯嘧磺隆（Chlorimuron-ethyl）是美國杜邦公司于20世紀80年代研制的一種磺酰脲類除草劑，被廣泛應用于大豆田中的闊葉雜草、莎草及某些禾本科雜草的防治。該除草劑殘效期長達2～3年，長期大量施用極易對后茬敏感作物造成藥害，在土壤中沉積可致敏感作物大量減產，形成大豆田輪作障礙［1］。在2004～2006年，牡丹江市應用氯嘧磺隆，乙草胺封閉除草發生藥害面積達12.23萬hm2，經濟損失上千萬元［2］。殘留的氯嘧磺隆會降低土壤酶活性，改變土壤微生物群落結構，導致土壤生產力下降，嚴重影響了農業結構調整，對生態環境和人類健康也會產生潛在威脅［3-6］。因此，減少此類除草劑在土壤中的殘留成為當前的研究熱點。

消除農業生產氯嘧磺隆等除草劑殘留，是現代農業綠色發展的關鍵。目前減輕甚至解除環境中磺酰脲類除草劑污染的措施主要包括化學水解和微生物降解，其中微生物代謝作用顯著［7］。篩選獲得高效氯嘧磺隆降解菌株是氯嘧磺隆污染土壤的微生物修復技術的核心和關鍵。目前已經報道的具有氯嘧磺隆降解能力的微生物有真菌，如擲孢酵母Sporobolomycessp.在含有10 mg/L氯嘧磺隆的麥芽汁液體培養基96 h后對氯嘧磺隆的降解率為90.12%；黑曲霉Aspergillus niger培養7 d后，可將初始濃度為10 mg/L的氯嘧磺隆降解，降解率達96.59%［8-11］。細菌如假單胞菌Pseudomonassp. LW3，7 d內可降解70%～80%初始濃度為50 mg/L的氯嘧磺隆；克雷伯氏菌Klebsiella jilinsis2N3在30℃、12 h內對100 mg/L氯嘧磺隆的降解率達92.5%；Hansschlegeliasp. CHL1在30℃、4 d可降解95%濃度為50 mg/L的氯嘧磺隆；紅球菌Rhodococcussp. D310-1在28℃、5 d可將100 mg/L氯嘧磺隆降解89%；嗜麥芽寡養單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaD310-3在 pH 5.95、30.15℃條件下，6 d后可降解89.9%濃度為50.21 mg/L的氯嘧磺隆，路德維希氏腸桿菌Enterobacter ludwigii在pH 7.0、30℃條件下，21 d后可降解90.8%濃度為10 mg/L的氯嘧磺隆［1，12-18］。此外，也有研究人員對菌株的降解途徑和功能基因及酶進行了研究。據報道，Ancylobactersp.XJ-412-1的carboxyesterase基因可將磺酰脲轉化為其脫酯衍生物，從而降解磺酰脲類除草劑（甲磺隆）［19］。克隆了一個新的酯酶基因sulE，并在Hansschlegelia zhihuaiaeS113中表達，而該酯酶能夠利用去酯化機制降解磺酰脲類除草劑［20］，分離并在Bacillus subtilisJH3中鑒定出糖基轉移酶，通過破壞S-N鍵，降解甲磺隆［21］。

目前已報道的氯嘧磺隆降解菌種類相對較少，僅分布在Rhodotorula、Enterobacter、Pseudomonas、Klebsiella等9個屬內，且降解效果并不突出。因此，繼續深入挖掘氯嘧磺隆高效降解菌株，豐富降解資源多樣性十分必要，為構建高效降解氯嘧磺隆基因工程菌和生產優質降解菌劑提供支撐。本研究從安徽合肥某磺酰脲類除草劑生產廠廢水處理活性污泥中分離出一株以氯嘧磺隆為唯一氮源的高效降解菌，對其進行分類鑒定及降解特性研究，并對其降解氯嘧磺隆的代謝途徑及相關降解基因進行探索，為該類除草劑污染環境的生物修復提供優良的降解微生物資源，也為氯嘧磺隆生物降解提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

供試樣品采自安徽合肥某磺酰脲類除草劑生產廠廢水處理池的活性污泥中，采集后裝入滅菌自封袋中帶回實驗室，用于氯嘧磺隆降解菌的分離。

1.1.2 主要試劑

氯嘧磺隆標準品購自合肥久易農資公司，純度為≥98%，Taq DNA聚合酶（MT201）、dNTPs、DNA Marker、所用引物購自北京博邁德有限公司，甲醇、乙腈等有機試劑均為色譜純，購自賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 培養基

MSM培養基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.5、K2HPO40.5、NaCl 0.2、CaCl20.1，pH 7.0；GSM培養基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.5、K2HPO40.5、NaCl 0.2、CaCl20.1、Glucose 5，pH 7.0；Luria-Bertani LB培養基（g/L）：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、Agar 20，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 氯嘧磺隆降解菌的富集與分離

取10 g污泥樣品，加入100 mL MSM培養基（含100 mg/L氯嘧磺隆）中，置于恒溫搖床中，在30℃避光振蕩培養（160 r/min）。培養7 d后，取10 mL培養液接入100 mL新鮮MSM無機鹽培養基中，每次提高氯嘧磺隆濃度100 mg/L，并使氯嘧磺隆終濃度達到500 mg/L。取最終富集的培養液，稀釋涂布至MSM固體培養基上（含100 mg/L氯嘧磺隆），于30℃條件下避光培養2 d，挑取生長較快的單菌落，經平板劃線純化，再分別接入含 50mg/L的氯嘧磺隆GSM培養液中，測量其降解能力，選取降解能力較強的菌株保存用于后續研究。

1.2.2 氯嘧磺隆降解菌的初步鑒定

形態特征鑒定：采用平板涂布法接種，30℃恒溫培養2 d后觀察菌落形態；采用革蘭氏染色法確定菌株革蘭氏類型。同時對獲得的降解菌進行16S rRNA基因擴增與測序，并對測序結果進行分析，具體如下：利用細菌基因組提取試劑盒（天根生物科技有限公司）提取菌株的基因組DNA，以此為PCR擴增模版，利用細菌16S rRNA基因的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行擴增。PCR擴增反應體系為Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，1492R 1 μL，27F 1μL，DNA template 2 μL；總體積為25 μL。PCR反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環，最后72℃延伸5 min。擴增產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，預計產物大小為1500 bp左右。將PCR產物送到北京博邁德有限公司進行測序。將測序結果提交至EzBioCloud進行序列比對，根據比對結果，下載相關模式菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA 7.0構建系統發育樹并分析。

1.2.3 氯嘧磺隆降解菌降解能力的測定

將分離到的菌株接種于GSM培養基中，于30℃、160 r/min的恒溫振蕩器上培養24 h后，將培養菌液在8000 r/min的轉速下離心5 min后，棄上清，菌體用新鮮的0.9% NaCl生理鹽水洗滌3次后重懸，以5%接種量加入含有50 mg/L氯嘧磺隆的GSM培養基中，于30℃、160 r/min條件下避光培養，研究降解菌對氯嘧磺隆的降解效果。檢測采用高效液相色譜法，具體檢測條件為色譜柱C18 反 相 柱（5 μm，4.6×150 mm i.d.，Diamonsil，USA），流動相為甲醇∶水∶冰乙酸=68∶32∶0.1（V∶V∶V），柱溫為28℃，檢測波長240 nm，進樣量為10 μL，流速為1 mL/min。依據檢測波長為240 nm處氯嘧磺隆的峰面積結果，通過標準曲線換算出培養液中氯嘧磺隆的濃度，再根據公式降解率（%）=（1-實測殘量/對照樣實測殘量）×100計算降解能力［22-23］。

1.2.4 氮源對氯嘧磺隆降解菌LAM2021降解能力的影響

將5 mL的LAM2021菌懸液（OD600為1.0）接種于100 mL含有不同氮源（CK、硫酸銨、磷酸二氫銨、尿素、蛋白胨、氯化銨）的GSM培養基中，置30℃、160 r/min條件下培養，每個處理設3次重復。

1.2.5 氯嘧磺隆降解菌降解特性及降解條件優化

菌株的降解特性研究包括菌株對溫度、pH及不同除草劑濃度的降解能力。設置不同溫度（20、30、40℃）、不同除草劑濃度（0、50、100 mg/L）、不同pH（5.0、7.0、9.0），研究不同條件對菌株LAM2021降解氯嘧磺隆的影響。每個處理設3次重復。將菌株接種至不同條件下含氯嘧磺隆的GSM培養基中作為處理組，以相同條件下不接入菌株為對照組。分別培養3、6、9 h后，取樣測定樣品中氯嘧磺隆殘留的濃度并根據1.2.3中的公式計算降解率。

利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken design（BBD）模型進行3因素3水平試驗設計，以pH（A）、溫度（B）、底物濃度（C）為自變量，以降解率為唯一響應值。二次回歸方程用以擬合自變量和響應值之間的函數關系。

1.2.6 短鏈有機酸的鑒定

利用HPLC檢測并鑒定菌株LAM2021在GSM培養基中產短鏈有機酸的情況，檢測條件：流動相為磷酸二氫銨（0.02 mmol/L，pH=2.7）與甲醇混合物（比例為85∶15，V∶V），進樣量為10 μL，光電二極管陣列檢測器的波長為210 nm，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，以分析純級草酸、L-蘋果酸、檸檬酸和富馬酸作為參照標樣。

1.2.7 菌株降解氯嘧磺隆中間代謝產物的檢測與代謝途徑推測

將菌株LAM2021接種于LB培養基中，培養至指數生長期，將培養液于8000 r/min條件下離心5 min，丟棄上清，收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌2次后制成OD600為1.0的菌懸液。以5%的接種量，將LAM2021菌懸液（OD600=1.0）接種到含50 mg/L氯嘧磺隆的GSM培養基中，以相同條件但不接菌為對照，分別培養1 d后取樣，上述所有實驗均設3次重復。使用配備電噴霧電離Xevo三重四極桿（Xevo-TQD）質譜儀（Waters Corp，Milford，MA，USA）進行檢測。質量模式m/z為100～450，Masslynx NTV的正模式（ESI+）和負模式（ESI-）的ESI源被用于收集和分析獲得的數據。

1.2.8 氯嘧磺隆降解菌全基因組測序及分析

將菌株LAM2021接種到LB液體培養基中，在160 r/min和30℃條件下振蕩培養2 d后，8000r/min離心5 min，用磷酸緩沖液洗滌，收集足量菌體，送至廣東美格基因科技有限公司開展全基因組測序工作，具體流程參考文獻［24］。菌株全基因序列文件組裝完成后，分析預測編碼基因、非編碼RNA、重復序列、CRISPR等基因組成分，并使用KEGG、GO、Swissprot、NR、COG等數據庫對編碼基因序列進行功能注釋。結合已報道和本實驗中獲得的對微生物降解氯嘧磺隆的信息，搜索并預測與降解相關的功能基因及其信息。

2 結果與分析

2.1 氯嘧磺隆降解菌的分離

經過富集培養和平板稀釋涂布分離，自磺酰脲類除草劑生產廢水處理池污泥中分離獲得1株對氯嘧磺隆具有高效降解效果的菌株LAM2021，11 h內對50 mg/L濃度的氯嘧磺隆降解率達到90%以上，對該菌株進行后續研究。該菌株為革蘭氏陰性菌（圖1A），在LB固體培養基上，菌落呈白色，不透明，表面光滑，形態呈圓形（圖1B）。

圖1 菌株LAM2021的革蘭氏染色結果與在LB平板上的菌落形態

2.2 基于16S rRNA基因序列系統發育分析

將菌株LAM2021的16S rRNA基因序列信息提交至GenBank數據庫（序列登錄號為MW429194），以該序列信息在EzBiocloud網站上進行序列比對，結果表明，LAM2021的16S rRNA基因序列與Kosakonia sacchari（JQ001784）相似性最高，達到99.32%；與Kosakonia pseudosacchari（FXWP01000029）的相似性是98.91%。從利用 NJ（Neighbor Joining method）法構建的系統發育樹（圖2）中可以看出，菌株LAM2021與來自Kosakonia屬的菌株聚在一起，形成一個獨立的分支，因此，初步將該菌株鑒定 為Kosakoniasp. LAM2021。Kosakonia sacchari的基因組信息在NCBI數據庫中下載。通過OrthoANIu algorithm（https：//www.ezbiocloud.net/tools/ani）分 析 疑似新種菌株與相似菌株的平均核苷酸水平（ANI）可得，LAM2021的基因組序列Kosakonia sacchari的ANI值是95.79%，Kosakonia pseudosacchari的ANI值是93.84%；同時利用Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1（http：//ggdc.dsmz.de/）對疑似新種與相似菌株間的DNA同源性（DDH）值進行計算。LAM2021的基因組序列Kosakonia sacchari的DDH值是65.30%，Kosakonia pseudosacchari的DDH值是54.10%。

圖2 菌株LAM2021 的 16S rRNA 序列構建的系統發育樹分析

2.3 氮源對氯嘧磺隆降解菌LAM2021降解能力的影響

將菌株LAM2021接種到不同氮源的GSM培養基中，于30℃、160 r/min條件下培養，結果見圖3。當葡萄糖作為碳源時，外加氮源能夠提高氯嘧磺隆的降解能力，其中氮源為硫酸銨，菌株的降解能力最強，因此氯嘧磺隆最佳的氮源是硫酸銨。

圖3 不同氮源對菌株LMA2021降解能力的影響

2.4 氯嘧磺隆降解菌降解條件優化

菌株LAM2021能以氯嘧磺隆為唯一氮源進行生長，從降解的實驗結果可以看出，不同氯嘧磺隆底物濃度對菌株LAM2021的降解率影響較小（圖4A），而在160 r/min、pH 7.0、接種量為5%的OD600=1.0的菌株LAM2021、氯嘧磺隆底物濃度為100 mg/L的條件下，溫度對菌株LAM2021的降解率影響較大（圖4B），菌株在30℃時的降解率達到最大值，為92.6%；菌株在20℃中9 h內幾乎不降解，說明菌株LAM2021在低溫下生長較慢。在160 r/min、30℃、接種量為5%的OD600=1.0的菌株LAM2021、氯嘧磺隆底物濃度為100 mg/L的條件下，pH為5.0～9.0的范圍內，降解率先增加后減少（圖4C），pH為7.0的降解率在9 h達到最大值88.6%，同時9 h后pH為5.0時，菌株的降解率達到100%。

圖4 不同環境因素對氯嘧磺隆降解的影響

2.5 響應面優化結果

利用Design-Expert 8.0.6，對BBD模型實驗數據進行多項回歸分析得到擬合模型：Y=-345.58+65.30A+13.83B+0.50978C-0.564AB-0.080AC-8.067BC-3.38A2-0.155B2-6.56C2，回歸方程中，Y為菌株LAM2021氯嘧磺隆降解率；其中A為pH、B為溫度、C為底物濃度。

利用Design-Expert 8.0.6分析得出菌株LAM2021對氯嘧磺隆降解率響應分析實驗回歸分析結果見圖4D。菌株LAM2021采用響應面實驗，結果顯示氯嘧磺隆的最佳降解條件為：在接種量5%的基礎上，30℃、pH 6.0，底物濃度50 mg/L。雖然pH為5.0時，氯嘧磺隆降解率可達100%，可以推斷出氯嘧磺隆在酸性條件下可以發生水解，但是酸性條件下氯嘧磺隆以化學水解為主，而中性或偏中性有利于菌株LAM2021的生長和降解酶活性的提高。

2.6 氯嘧磺隆降解菌LAM2021產生的短鏈有機酸的鑒定

菌株LAM2021在含氯嘧磺隆的GSM培養基中培養，培養液體系pH在1 d之內從7.0降至3.4，由于氯嘧磺隆在酸性條件下極不穩定，推測菌株LAM2021對氯嘧磺隆的降解存在由于pH下降造成酸解的機制。利用HPLC對菌株的培養液進行了檢測，發現其中有檸檬酸的產生。同時不同時間取樣，發現在22 h有檸檬酸的大量累積，累積量高達750 mg/L（圖5）。

圖5 降解菌LAM2021在GSM培養基產生的短鏈有機酸

2.7 菌株LAM2021降解氯嘧磺隆代謝產物檢測及其代謝途徑推測

利用LC-MS檢測了菌株LAM2021與氯嘧磺隆共培養1 d后的中間代謝產物。通過ESI源檢測結果表明，在陰離子模式中，共檢測到5個片段，質荷比分別為413.03、228.03、200、181.99、158.01 m/z。根據一級和二級質譜的結果及其氯嘧磺隆自身的結構特征，初步判定物質A是氯嘧磺隆，物質B是鄰甲酸乙酯苯磺酰胺，物質C是鄰甲酸苯磺酰胺，物質D是N-醛基糖精，物質E是2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶（圖6）。

圖6 降解菌LAM2021的代謝產物

氯嘧磺隆在GSM培養基中，在微生物的作用下，磺酰脲橋首先發生斷裂，生成產物2-氨基-4-氯-6甲氧基嘧啶（產物E）和鄰甲酸乙酯苯磺酰胺（產物B）。鄰甲酸乙酯苯磺酰胺繼續在微生物的代謝作用下發生水解反應，生成鄰甲酸苯磺酰胺（產物C）。由于鄰磺酰胺苯甲酸不穩定，發生環化反應，生成N-醛基糖精（產物D）。基于以上檢測到的代謝產物，推測LAM2021降解氯嘧磺隆的代謝途徑如圖7所示。

圖7 降解菌LAM2021的代謝途徑

2.8 氯嘧磺隆降解菌的基因組信息

將菌株LAM2021的基因組信息提交至NCBI數據庫（序列登錄號為：JAENHT000000000），全基因組測序結果如表1所示。

表1 LAM2021的基因組組分分析

基于已報道的氯嘧磺隆降解基因信息，菌株LAM2021中有17個可能與降解相關的功能基因，包括2個羧酸酯酶基因、5個糖基轉移酶基因、10個酯酶基因。

3 討論

3.1 氯嘧磺隆的降解

長期大量施用氯嘧磺隆產生的殘留會對后茬敏感作物造成一定的藥害，造成產量下降，同時也會造成環境污染，還會通過食物鏈影響人類健康。因此探尋高效、安全、經濟的除草劑污染環境治理方法十分迫切。在生態系統中，微生物對于農藥的降解起著關鍵的作用，以微生物修復理論為基礎的除草劑殘留降解技術是解決土壤修復問題的有效途徑［25］。目前，已報道的可降解細菌種屬以假單胞菌和黃桿菌屬為代表的革蘭氏陰性菌占多數，這些細菌借助外壁層脂多糖保護，免受農藥的毒害，對多種農藥有分解作用［26］。本研究從某磺酰脲類除草劑生產廠廢水處理池活性污泥中，富集馴化分離出一株氯嘧磺隆高效降解菌LAM2021，經16S rRNA基因序列比對分析，初步將該菌株鑒定為Kosakoniasp.，這是首次關于Kosakonia屬菌株具有氯嘧磺隆降解功能的報道，豐富了氯嘧磺隆降解微生物資源多樣性。

3.2 初探氯嘧磺隆降解菌降解氯嘧磺隆的降解機理

在已報道的氯嘧磺隆微生物降解途徑與相關機制中，氯嘧磺隆主要通過脲橋斷裂和酯鍵斷裂兩類反應完成降解。Ma等［12］在氯嘧磺隆的降解產物研究中發現代謝產物2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶。Zou等［27］在真菌TR-H降解氯嘧磺隆過程中發現鄰磺酰苯甲酸亞胺和2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶兩種產物。在本研究中，利用LC-MS共檢測到4種代謝產物（鄰磺酰苯甲酸亞胺、鄰甲酸乙酯苯磺酰胺、鄰甲酸苯磺酰胺和2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶）。同時監測到菌株與氯嘧磺隆共培養過程中，體系的pH從7.0減少到3.4，致使環境酸化，造成氯嘧磺隆的脲橋發生斷裂［28］。HPLC檢測結果表明，這是由于菌株在代謝過程中主要產生檸檬酸所致。同時該菌株中還有多個已報道的參與氯嘧磺隆降解的功能基因，如羧酸酯酶基因、細胞色素P-450基因和糖基轉移酶基因等［29］，其中羧酸酯酶主要參與氯嘧磺隆的酯鍵斷裂［30］。

4 結論

本研究從安徽合肥某磺酰脲類除草劑生產廢水處理池污泥中分離獲得一株高效氯嘧磺隆降解菌Kosakoniasp. LAM2021。通過RSM方法優化出該菌株的最佳降解條件為：30℃，底物濃度為50 mg/L，pH為6.0。在此條件下，降解率為94.6%。基于代謝產物初步推定了菌株降解氯嘧磺隆的降解途徑；菌株代謝氯嘧磺隆過程中主要通過代謝產生檸檬酸，排出胞外致使環境酸化，造成除草劑脲橋斷裂。通過菌株的全基因組信息分析，發現該菌株含有大量已報道參與氯嘧磺隆降解的功能基因。本研究從菌株降解特性、降解條件優化、代謝途徑及降解相關功能基因4個層面系統探索了新分離菌株Kosakoniasp. LAM2021對氯嘧磺隆的降解特性及代謝機理，結果表明，該菌株對氯嘧磺隆具有較高的降解能力，為今后高效降解工程菌株的構建與功能菌劑的開發提供了優良的菌株。