基于LTB4/BLTR通路探討黃芩苷-梔子苷配伍對局灶性腦缺血大鼠再灌注損傷的影響

周爽，李慧敏，張行行，史永恒，王川，王國全，李敏，王斌（陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

腦缺血損傷可觸發一系列的有害事件，包括谷氨酸相關的興奮性毒性、炎癥、氧化應激和細胞凋亡。近年來，越來越多的研究關注炎癥在腦缺血發病中的作用。缺血性病變中分泌的炎癥介質，包括細胞因子、前列腺素、自由基和趨化因子，可以招募其他免疫細胞，參與已經過度激活的炎癥反應，導致腦細胞進一步損傷。因此，調節炎癥相關通路，減少炎癥因子的釋放，對改善腦損傷具有重要意義。白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）是不飽和脂肪酸通過5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）途徑中重要的下游代謝產物，與細胞膜上的白三烯受體（leukotriene B4 reportor，BLTR）結合。BLTR即BLT1 和BLT2，參與并增強炎癥反應。越來越多的證據表明，血漿中LTB4 水平可以作為急性腦卒中患者臨床預后不良的生物標志，但LTB4 在腦損傷中的作用機制尚不明確。

黃芩苷（BC）、梔子苷（GP）是中藥黃芩和梔子的主要活性成分。依據中醫基礎理論“清熱解毒”的現代化研究，課題組的前期實驗研究發現，BC/GP（最佳配伍比例7∶3）聯合應用可減輕腦缺血大鼠缺血區的炎性損傷和組織水腫，可緩解腦缺血損傷后的炎癥反應，并通過下調5-LOX 起到腦保護的作用。有研究指出，抑制5-LOX 的凈效應可能掩蓋了LTB4 的作用，如影響中性粒細胞浸潤和細胞因子等作用。為進一步探討BC/GP 是否調控LTB4 發揮抗腦缺血損傷的作用機制，本實驗建立腦缺血大鼠再灌注模型，探討LTB4 通路在腦缺血再灌注中的作用機制，及BC/GP 是否可以有效調控LTB4/BLTR 通路降低腦損傷，為進一步研究缺血性腦卒中的診斷和臨床治療提供依據。

1 材料

1.1 儀器

大鼠LTB4-ELISA 試劑盒（深圳欣博盛科技有限公司，批號20160712）；ElX800 酶標儀（Bio-TEK 公司）；miniprotean3cell 電泳儀（Bio-R-AD 公司）；Milli-Q 純水機（Millipore 公司）；5430R 型冷凍離心機（Eppendorf 公司）。

1.2 試藥

黃芩苷、梔子苷（北京索萊寶生物公司，含量≥98%，批號：20201007）；白三烯B4 受體阻斷劑LY255283（abcam，HY-15744）；BLT1抗體（abcam，ab95492）；BLT2 抗體（abcam，ab115453）；腫瘤壞死因子-

α

（TNF-

α

）、髓過氧化物酶（MPO）、白介素-1

β

（IL-1

β

）、白三烯B4（LTB4）ELISA 檢測試劑盒（武漢博士德）。

1.3 動物

SPF 級SD 雄性大鼠120 只，體質量180 ～220 g[許可證號SCXK（川）2020-030，成都達碩實驗動物有限公司，于陜西中醫藥大學中藥藥理實驗室飼養]。適應性喂養一周，自由飲食飲水。

2 方法

2.1 藥品制備

根據給藥劑量不同，稱取一定量黃芩苷、梔子苷藥物粉末，共同溶劑于適量純凈水中，超聲10 min，至4℃冰箱保存，藥液使用前振搖混勻。取LY255283 粉末10 mg 溶解于DMSO 中，定容至10 mL 備用。

2.2 分組及造模

將SD 雄性大鼠隨機分為7 組，每組15 只，分別為假手術組（sham），模型組（model），白三烯B4 受體抑制劑組（LY255283，1 mg·kg），黃芩苷-梔子苷7∶3 配伍組低、高劑量組（BC/GP 組，45 mg·kg、60 mg·kg）和BC/GP 聯合抑制劑組（BC/GP45 ＋LY255283、BC/GP60 ＋LY255283）。適應性喂養一周后，除假手術組外，其余組采用線栓法制備大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。大鼠經麻醉后，仰臥位固定于手術板上，頸部去毛，消毒，縱向切開頸部正中皮膚，逐層鈍性分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎頸外動脈，在頸總動脈上距離頸內動脈交叉 5 mm處造口，插入線栓，至有微弱阻力時停止，扎緊線栓以防止滑落，縫合傷口，缺血后2 h 拔栓，恢復血流供應；假手術組相同處理但不進行結扎、造口和插栓操作。各組術后于（23±2）℃條件下喂養，正常飲食進水。

2.3 給藥

大鼠適應性飼養一周后，按照BC/GP 45 mg·kg和60 mg·kg（1 mL/100 g）灌胃給藥，連續7 d，每日一次。LY255283 組、BC/GP45 ＋LY255283 組、BC/GP60 ＋LY255283 組在手術造模前30 min 腹腔注射LY255283（1 mg·kg），假手術組和模型組注射等體積的生理鹽水。

2.4 神經功能評價

大鼠稱重后，用10%水合氯醛（0.3 mg·kg）腹腔注射麻醉，通過改良Longa 線栓法來建立大腦中動脈局灶性梗死MCAO 模型（右側）。缺血2 h 后松開動脈夾再灌注24 h。神經功能學評分參考Zea-Longa 5 分制評分標準，所有大鼠均在模型成功后觀察大鼠行為。評分標準為0 分：無神經功能缺陷征；1 分：一側前肢部分屈曲；2 分：一側前肢完全屈曲；3 分：向偏癱側轉圈；4 分：向偏癱側傾倒；5 分：不能自發行走，意識喪失。大鼠手術蘇醒后，進行Zea-Longa 評分，評分1 ～4 分則納入實驗。拔出線栓，再灌注24 h 觀察并記錄神經功能缺損癥狀，進行神經嚴重程度評分（mNSS）。

2.5 大鼠腦組織切片HE 染色

腦組織4%多聚甲醛固定腦組織，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯脫醇；浸蠟包埋；切片，厚度5 μm；再以二甲苯、乙醇脫蠟；蘇木素浸泡20 min，酸水分化；純凈水浸泡20 min；0.5%伊紅染色2 min，沖洗；梯度乙醇脫水，樹脂封片。在病理顯微鏡下拍照。

2.6 酶聯免疫法檢測相關因子在腦組織含量

采用ELISA 試劑盒檢測腦梗死皮層的大鼠腦組織白三烯A4 水解酶（LTA4H）、LTB4、MPO 和炎性因子的含量。24 h 取材，將腦組織置于液氮后，研磨后取上清液，嚴格按照試劑盒操作測定。

2.7 Real-time PCR 檢測BLTR 在腦組織中的含量

取勻漿管，加入1 mL 的RNA 提取液，置冰上預冷。取100 mg 組織，加入到勻漿管中。勻漿儀充分研磨直至無可見組織塊。樣本前處理之后，12 000 r·min離心10 min 取上清液。加入250 μL 三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min，4℃、12 000 r·min，離心10 min，將400 μL 上清液轉移到一新的離心管中。加入0.8 倍體積的異丙醇，顛倒混勻。－20℃放置15 min。4℃、12 000 r·min離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。溶解RNA 將離心管置于超凈臺上吹3 min，加入15 μL 無RNA 酶的水溶解RNA，55 ℃ 孵育5 min。檢測RNA 濃度。進行反轉錄，反應體系：5×Reaction Buffer 4 μL、dT引物（100 μmol·L）0.5 μL、dNTP 混合物（100 μmol·L）0.5 μL、反轉錄酶1 μL、總 RNA 10 μL、DEPC 處理水添加20 μL。取0.2 mL PCR 管，配制如下反應體系：2×qPCR Mix、7.5 μL 2.5 μmol·L基因引物 1.5 μL、反轉錄產物 2.0 μL、ddHO 4.0 μL，每個反轉錄產物配制3 管。定量PCR 擴增反應條件：95 ℃預變性10 min，95℃、15 s，60 ℃、30 s，熔解曲線 60 ～95℃，每升溫0.5℃采集一次熒光信號（循環40 次）。以GAPDH 為內參，采用2法計算mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列
Tab 1 Primer sequence

基因名稱F（5'→3'）R（5'→3'）LTA4HGGAGAAAGCCAGGGTTACAAAGTGCTTTCCTGAAGTCTGCTCG BLT1TTTCCTACACTTTCTGGCTCGGTTCTTGGGTGTTACTGTGCGGT BLT2GAGACCCTGACTGCCTTCGTCGCCTGTAGGAGATTGACCG GAPDHCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGGGTGGAAGAATGGGAGTTGCT

2.8 統計分析

所有統計分析均使用Graphpad Prism 5 軟件進行。實驗數據以

x

±

s

表示。同一時間點的比較采用獨立樣本

t

檢驗。多組之間比較采用單因素方差分析，兩組間資料比較采用LSD 檢驗。

P

＜0.01 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注神經功能損傷的影響

如圖1 所示，與假手術組比，手術造模后大鼠神經功能損傷嚴重，麻醉蘇醒后出現在水平地面上向輕癱側傾倒行為，再灌注24 h 后向輕癱側轉圈，提尾表現為前肢屈曲，頭部在30 s 內偏離垂直軸＞10°或出現癲癇、肌陣攣、肌張力障礙等行為，平衡木測試中出現試圖在平衡木上平衡但跌落（＞20 s）的現象。與模型組相比，LY255283 組神經功能評分無明顯差異。BC/GP組大鼠行為表現相似，各項評分較模型組差異有統計學意義（

P

＜0.01），BC/GP 聯合抑制劑組的神經損傷顯著降低（

P

＜0.01，

P

＜0.001）。假手術組無神經功能障礙的表現。結果表明BC/GP可以降低神經功能損傷。

圖1 各組腦缺血再灌注大鼠神經功能評分結果（n ＝15）Fig 1 Neurological function score of rats with cerebral ischemiareperfusion in each group（n ＝15）

3.2 BC/GP 調控LTB4 通路對大鼠腦組織病理形態的影響

HE 染色結果顯示，與假手術組相比，腦缺血再灌注后腦組織大范圍損傷，損傷處組織腫脹變大，著色明顯變淡；皮層和紋狀體區神經元大量壞死，神經元數量減少，多見胞核固縮或消失，可見散在的炎性細胞浸潤；神經纖維結構松散，紋狀體神經纖維團結構模糊等現象。部分神經元胞體和胞核腫脹，核質疏松，神經纖維水腫，結構松散，纖維團破裂，有的結構模糊不清；局部紋狀體下方明顯壞死，結構疏松；紋狀體神經纖維團結構模糊，有的甚至液化，結構疏松。與模型組相比，LY255283 組病理形態得到改善，BC/GP 組紋狀體結構松散減輕，神經壞死現象明顯改善。BC/GP 聯合抑制劑組的神經壞死現象也有改善。假手術組的腦組織各結構清晰，著色均勻，未見明顯梗死灶。結果表明抑制LTB4 受體的表達改善病理形態的效果并不明顯，BC/GP 可以有效改善腦組織病理形態（見圖2）。

圖2 各組大鼠缺血側腦組織皮質部分形態學觀察（HE，×20）Fig 2 Morphological of cerebral cortex on ischemic side of rats in each group（HE，×20）

3.3 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中LTA4H、LTB4 和血清中LTB4 的影響

與假手術組相比，腦缺血再灌注后腦組織中LTA4H、LTB4 和血清中LTB4 的表達顯著增加（

P

＜0.01）；與模型組相比，LY255283組LTA4H 和LTB4 的表達顯著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01），BC/GP 組 LTB4 和LTA4H 的表達顯著降低（

P

＜0.01）。并且BC/GP（60 mg·kg組）可以降低血清中 LTB4 的表達（

P

＜0.05)。結果表明，BC/GP 配伍可以顯著降低LTB4 的表達，提示BC/GP 可能可以通過抑制LTB4 在腦缺血后發揮作用（見圖3）。

圖3 腦缺血再灌注后LTB4 的測定結果（n ＝3）Fig 3 LTB4 and MPO after the cerebral ischemia-reperfusion（n ＝3）

3.4 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中MPO的影響

MPO 是中性粒細胞的陽性標記物。如圖4所示，與假手術組相比，腦缺血再灌注后腦組織中MPO 的表達顯著增加（

P

＜0.01）；與模型組相比，LY255283 組的MPO 表達顯著降低（

P

＜0.01），給予BC/GP 顯著降低MPO 的表達（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。結果表明，BC/GP 可以降低腦損傷后MPO 的表達和中性粒細胞浸潤。

圖4 腦缺血再灌注后MPO 的測定結果（n ＝3）Fig 4 Expression of MPO after the cerebral ischemia-reperfusion（n＝3）

3.5 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中BLT1 和BLT2 mRNA 的影響

RCR 結果顯示，與假手術組相比，腦缺血再灌注后BLT1 和BLT2 的mRNA 顯著升高（

P

＜0.01）；與模型組相比，LY255283 顯著抑制BLT1 和BLT2 mRNA 的表達（

P

＜0.01），BC/GP顯著降低BLT1 和BLT2 mRNA 的表達（

P

＜0.01），BC/GP 聯合LY255283 顯著抑制BLT1 用和BLT2 mRNA 的表達（

P

＜0.01）。結果表明BC/GP 可以抑制LTB4 與BLT1 和BLT2 受體結合而發揮作用（見圖5）。

圖5 各組BLT1 和BLT2 mRNA 的測定結果（n ＝3）Fig 5 BLT1 and BLT2 mRNA in each group（n ＝3）

3.6 BC/GP 調控LTB4 通路對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中炎性因子的影響

如圖6 所示，與假手術組相比，腦缺血大鼠再灌注24 h 后大鼠腦組織中促炎因子TNF-

α

和炎性因子IL-1

β

表達顯著增加（

P

＜0.01）；與模型組相比，LY255283 組TNF-

α

的表達顯著降低（

P

＜0.01）。 給予BC/GP 以及BC/GP 聯合LY255283 可以顯著降低TNF-

α

和IL-1

β

表達（

P

＜0.01）。結果表明，抑制LTB4/BLTR 表達來影響炎性因子的釋放，下調LTB4 通路的表達會降低腦缺血后炎性因子的表達。BC/GP（7∶3）配伍可以降低炎性因子和改善腦損傷，其抗炎作用可能與下調LTB4/BLTR 通路有關。

圖6 各組炎性因子TNF-α 和IL-1β 的測定結果（n ＝3）Fig 6 TNF-α and IL-1β inflammatory factor in each group（n ＝3）

4 討論

腦缺血后缺血損傷區存在多種細胞因子表達、炎性細胞浸潤和氧自由基反應，可加速缺血后細胞損傷。缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中進展過程中最重要的部分，能量代謝異常，離子代謝紊亂、自由基損傷、炎癥反應等都參與了缺血再灌注損傷的復雜病理機制。炎癥反應在腦缺血損傷發生后被激活，導致神經細胞凋亡、死亡和組織損傷。LTB4 主要在巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞中表達，與細胞表面G 蛋白偶聯受體結合，即LTB4 的受體（BLTR），產生多種細胞內信號。LTB4 能激活粒細胞，生成超氧陰離子，對白細胞具有強效的活化作用，刺激白細胞趨化、聚集、釋放氧自由基和溶酶體酶，使血管通透性增加，血管壁收縮，這些生理特性被認為加重了缺血引起的細胞損傷。近年來不斷有研究發現，在大鼠腦缺血中心區中，神經元和小膠質細胞BLT4 合成增加。在腦缺血模型前頸動脈注射LTB4 可增加梗死組織的體積，皮瓣抑制劑BAY-X1005 和BLT 拮抗劑LY255283可減少梗死體積。上述結果證明LTB4 在腦缺血中的產生是有害的，可使組織梗死程度惡化。本研究檢測了LTB4 在急性大鼠腦卒中模型中的水平及其機制，結果證實了在腦缺血再灌注損傷后LTB4 表達顯著增加。

目前已知BLTR 有兩種亞型，即BLT1 和BLT2。LTB4 通過BLT1 引起炎癥趨化因子和細胞因子的釋放，BLT1 參與了許多炎癥性疾病，如中性粒細胞在病變部位積聚。有報道稱，BLT2激活導致活性氧（ROS）升高，隨后激活NF-

κ

B。LY255283 是一種非選擇性拮抗劑，可同時抑制BLT1（非競爭性）和BLT2（競爭性）介導的Ca動員。因此，所觀察到的LY255283 的保護作用可能涉及其中一種或兩種亞型。有研究表明，5-LOX 炎癥途徑在許多疾病中均被激活，引起炎癥反應，BLT1 和BLT2 是主要的促炎介質。5-LOX 的抑制劑也具有腦保護作用，BLT1 拮抗作用在于不干擾除LTB4 外的脂質代謝物，相比于5-LOX 可作為更有優勢的治療靶點，因此，抗炎和神經保護作用的凈效應應該比在5-LOX 抑制的情況下更為顯著。并且與BLTR 拮抗劑相比，5-LOX 抑制劑選擇性較低，消耗多種產物，其中包括對缺血損傷有益的產物（如脂素A4 是5-LOX 的抗炎產物，可以抑制白三烯合成，對腦缺血具有神經保護作用），因此，BLTR 拮抗劑應該是比5-LOX 抑制劑更好的選擇。當缺血性腦損傷發生時，激活免疫反應，進而誘發一系列級聯反應如炎癥反應中TNF-

α

和IL-1

β

等的表達，加劇腦損傷。中性粒細胞浸潤被認為是缺血再灌注損傷主要的潛在的機制之一。MPO 是中性粒細胞的陽性標記物，本實驗結果表明，在急性腦缺血腦損傷中，LTB4、MPO 和炎性因子的表達顯著增加，LY255283 可降低腦損傷組織中IL-1

β

和TNF-

α

表達，表明其可阻斷LTB4 通路有效抑制炎性因子的產生，從而減輕炎性損傷。LY255283 還可降低MPO 的表達和中性粒細胞浸潤，改善腦缺血再灌注的損傷。腦損傷后LTB4 表達顯著增加，LTA4H 是合成LTB4 的關鍵酶。BC/GP 可以顯著抑制LTA4H/LTB4/BLTR 的表達，減輕神經功能缺陷，降低白細胞浸潤，改善腦組織的病理形態變化。BC/GP可以減輕神經功能損傷，顯著降低急性腦缺血時期的炎性因子表達，降低中性粒細胞浸潤。說明BC/GP 可以通過抑制LTB4 通路起到腦保護的作用。此外，實驗結果發現BC/GP（7∶3）配伍聯合LY255283 對LTB4/BLTR 通路的抑制作用顯著增強，推測BC/GP 可能通過多種途徑抑制了LTB4/BLTR 通路。

綜合以上結果，BLTR 抑制劑可以起到抗炎和神經保護的作用，BC/GP 可以通過下調LTB4/BLTR 通路在腦缺血再灌注損傷中起到腦保護作用。后續將建立體外細胞模型研究LTB4/BLTR在腦缺血再灌注損傷中的作用機制，并且進一步闡述黃芩苷-梔子苷配伍對腦缺血損傷的保護作用機制。