金銀花提取物增強抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷活性

單賀珍，董石，李曉瑞，董宇曦，劉秀盈，何宇，王建勛，2*（.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 02488；2.深圳北京中醫藥大學研究院，廣東 深圳 5872；.中國農業大學生物學院，北京 009）

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞免疫療法是抗腫瘤領域的一種新型細胞療法。近年來，多款抗CD19 CAR-T細胞產品陸續獲批上市，它對B細胞惡性淋巴瘤的療效顯著，特別是彌漫性大B細胞淋巴瘤，完全有效率可達54%。然而，抗CD19 CAR-T細胞療法的不良反應不可忽視，比如神經毒性和細胞因子綜合征（cytokine release syndrome，CRS），嚴重者甚至會危及患者的生命。

中藥金銀花（Lonicera japonica，LJ）具有清熱解毒、抗炎消腫的功效，臨床上廣泛用于發熱、扁桃體炎、肺炎、鼻炎及皮疹等。有體外實驗表明，金銀花提取物可以阻礙脂多糖誘導神經小膠質細胞與免疫巨噬細胞分泌炎癥因子，抑制補體活性。這提示金銀花可能有助于緩解抗CD19 CAR-T細胞導致的CRS。

因此，本實驗將金銀花水煎劑與抗CD19 CAR-T細胞聯合處理表達CD19的Burkitt’s淋巴瘤細胞（Raji細胞），以探究金銀花對抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷能力，細胞因子釋放以及程序性死亡蛋白（programmed death-1，PD-1）表達的影響，以期為惡性B細胞淋巴瘤患者提供新的治療方案。

1 材料

1.1 儀器

流式細胞分析儀（LSRFortessa SORP，BD）；酶標儀（Epoch 2TC，BioTek）；細胞自動計數儀（Invitrogen Countess II FL，ThermoFisher）。

1.2 試藥

RPMI 1640培養基、AIMV培養基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；CD3-APC抗體、PD-1-PE抗體、c-Myc-PE抗體、Human CD8/NK Panel檢測試劑盒、CFSE熒光染料（Bio-Legend公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（北京金普來生物科技有限公司）；Bright-LumiⅡ螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；金銀花中藥飲片[中國北京同仁堂（集團）有限公司]。

1.3 細胞系

Burkitt’s淋巴瘤細胞（Raji細胞，美國 ATCC細胞庫）；Raji-熒光素酶標記細胞（Raji-Luc，北京維通達公司）；外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC，為健康志愿者提供）。本研究獲得北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審理與批準，審批號為2022 BZYLL0102。

2 方法

2.1 金銀花提取物的制備[7]

稱取金銀花30 g，以8倍量去離子水浸泡30 min，加熱煮沸2 h，以三層紗布過濾。最后水浴濃縮至300 mL，即獲得質量濃度為100 mg·mL的金銀花水煎劑，0.22 μm濾膜過濾。

2.2 抗CD19 CAR-T細胞的構建與轉導率測定[8]

采用Ficoll 密度梯度離心法分離人外周血中的PBMC，以含有10%FBS的AIMV 培養基培養。T細胞激活則通過CD3 單克隆抗體與白介素-2（IL-2）刺激處理，繼續培養48 h后，轉導抗CD19 CAR反轉錄病毒（實驗室前期制備并保存）得到抗CD19 CAR-T細胞。48 h后通過c-Myc-PE染色與流式細胞術檢測c-Myc 陽性細胞，即獲得CD19 CAR的轉導效率。

2.3 熒光素酶檢測法測定靶細胞活率

將抗CD19 CAR-T細胞或T細胞依照1∶8效靶比與4×10個Raji-Luc細胞置于96孔培養皿100 μL體系中，給藥組分別給予5、10、20 mg·mL金銀花水煎劑干預。37℃共同培養12 h后，每孔加入100 μL熒光素酶底物，孵育3 min后使用酶標儀的化學發光模式檢測。根據下列公式計算不同組別的細胞殺傷效率：細胞殺傷效率（%）＝（靶細胞組檢測值－實驗組檢測值）/靶細胞組檢測值×100%。

2.4 Annexin V染色法檢測靶細胞凋亡

將抗CD19 CAR-T細胞依照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養12 h后，以CD3-APC抗體標記T細胞，Annexin-FITC標記早期凋亡細胞后，通過流式細胞術測定Raji細胞的凋亡比例。根據下列公式計算不同組別的細胞殺傷效率：細胞殺傷效率（%）＝（實驗組FITC陽性率－靶細胞組FITC陽性率）/（1－靶細胞組FITC陽性率）×100%。

2.5 CFSE染色法測定效應細胞增殖

將抗CD19 CAR-T細胞與3 μmol·L羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）孵育染色30 min，流式細胞術檢測0 h的FITC通道熒光強度；之后抗CD19 CAR-T細胞按照1∶8效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養12 h，以CD3-APC抗體標記T細胞，檢測12 h的FITC通道熒光強度。

2.6 CBA多因子流式細胞術檢測細胞因子釋放水平

將抗CD19 CAR-T按照1∶8效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養12 h后，收取培養基上清液，按照Human CD8/NK Panel檢測試劑盒說明書操作并檢測。

2.7 流式細胞術檢測PD-1的表達水平

將抗CD19 CAR-T按照1∶8效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養12 h后，以CD3-APC抗體標記T細胞，PD-1-PE抗體標記PD-1蛋白，抗體孵育1 h后采用流式細胞術檢測。

2.8 數據統計與分析

采用Graphpad Prism 9軟件進行統計學分析，兩組之間采用

t

檢驗，

P

＜0.05則表明差異有統計學意義。

3 結果

3.1 抗CD19 CAR-T細胞的成功制備

抗CD19 CAR-T細胞的構建是通過基因重組技術將載有CD19 CAR的反轉錄病毒轉導至T細胞，使其可以識別腫瘤細胞表面的CD19從而特異性殺傷腫瘤，其中CD19 CAR的分子結構主要包括CD19的單鏈可變片段（scFv）、CD8鉸鏈區、CD28共刺激域以及CD3

ζ

結構域（見圖1A）。轉染48 h后采用c-Myc抗體標記CD19 CAR分子以評估病毒的轉導效率，結果發現T細胞中CD19 CAR分子的表達率為65.7%（見圖1B）。

圖1 靶向CD19的嵌合抗原受體（CAR）的分子結構（A）及其表達率（B）Fig 1 Structure（A）and transduction efficiency（B）of anti-CD19 chimeric antigen receptor（CAR）

3.2 金銀花提取物提高抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷活性

為了探究金銀花提取物是否會影響抗CD19 CAR-T細胞的體外細胞毒性，將效應細胞與Raji-Luc共培養，給藥組給予金銀花提取物干預12 h，通過熒光素酶檢測法測定Raji-Luc的存活率。濃度摸索實驗發現，10 mg·mL的金銀花提取物可以促進抗CD19 CAR-T細胞殺傷腫瘤，優于5 mg·mL和20 mg·mL兩個質量濃度組（見圖2A）。于是將10 mg·mL作為后續實驗中金銀花提取物的最佳干預濃度。此外，還發現金銀花與抗CD19 CAR-T細胞聯合殺傷Raji-Luc的效果顯著優于兩者的單獨應用，即兩者具有疊加效應，也強于未轉導T細胞與金銀花聯用組以及未轉導T細胞組（見圖2B）。

圖2 熒光素酶檢測法測定抗CD19 CAR-T對Raji-Luc的殺傷效率（n＝3）Fig 2 Killing efficienc of anti-CD19 CAR-T cells against Raji-Luc measured by luciferase assay（n＝3）

進一步通過流式細胞術的方法檢測了不同效靶比條件下，10 mg·mL的金銀花提取物是否均會影響抗CD19 CAR-T細胞對Raji細胞的促凋亡作用，結果顯示，1∶2、1∶4、1∶8與1∶16效靶比水平下，金銀花與抗CD19 CAR-T細胞聯合應用組的腫瘤殺傷活性均顯著高于抗CD19 CAR-T細胞組（見圖3）。

圖3 細胞凋亡檢測法測定抗CD19 CAR-T對Raji細胞的殺傷效率（n＝3）Fig 3 Killing efficiency of anti-CD19 CAR-T cells against Raji cells measured by cell apoptosis assay（n＝3）

3.3 金銀花提取物促進抗CD19 CAR-T細胞的增殖

CAR-T細胞增殖能力同體內抗腫瘤的持久性密切相關，于是通過CFSE染色法測定了經10 mg·mL金銀花提取物處理的抗CD19 CAR-T細胞，結果顯示，與靶細胞共培養12 h后，同抗CD19 CAR-T細胞組相比，金銀花聯合應用組的CFSE熒光峰圖向左偏移（見圖4），即金銀花提取物提高了抗CD19 CAR-T細胞的增殖能力。

圖4 CFSE染色測定抗CD19 CAR-T細胞的增殖能力Fig 4 Proliferation ability of anti-CD19 CAR-T cell measured by CFSE staining

3.4 金銀花提取物雙向調控細胞因子的分泌

細胞因子的釋放水平是指征CAR-T細胞功能的標志之一，于是對抗CD19 CAR-T細胞與Raji細胞共培養體系中白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子

α

（TNF-

α

）、干擾素

γ

（IFN

-γ

）以及顆粒酶B（Granzyme B）的水平進行檢測。結果發現經10 mg·mL金銀花提取物處理后，Granzyme B顯著上調，IL-2與TNF-

α

有表達升高的趨勢；同時IFN

-γ

與IL-10顯著下調，IL-6表達有降低的趨勢（見圖5）。

圖5 金銀花提取物特異性調控細胞因子的分泌水平（n＝3）Fig 5 Expression level of cytokines regulated by Lonicera japonica extract（n＝3）

3.5 金銀花提取物下調PD-1蛋白的表達

為了進一步闡明金銀花提取物增強抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷能力的可能原因，對抗CD19 CAR-T細胞活性相關的免疫檢查點PD-1蛋白進行檢測，結果發現，同對照組相比，經10 mg·mL金銀花處理的抗CD19 CAR-T細胞的PD-1陽性率發生降低（見圖6）。

圖6 流式細胞術檢測PD-1蛋白表達的陽性率Fig 6 Expression of PD-1 detected by flow cytometry

4 討論

CD19是B細胞的生物標志物，屬于免疫球蛋白超家族，并在多數慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病以及B細胞淋巴瘤病例中高水平，且為血液腫瘤治療的潛在靶點。針對CD19靶標設計的抗CD19 CAR-T細胞可以特異性識別高表達CD19的B細胞淋巴瘤并激活自身T細胞的功能，進而精準清除癌變細胞。Raji細胞是取自Burkitt’s淋巴瘤患者的癌變B細胞，可作為評估靶向CD19 CAR-T細胞效力的靶細胞。基于成功制備的抗CD19 CAR-T細胞與Raji細胞共培養體系，實驗發現10 mg·mL金銀花提取物有助于提高抗CD19 CAR-T細胞的細胞毒性，改善抗CD19 CAR-T細胞的增殖，提示金銀花提取物與抗CD19 CAR-T細胞的聯合療法具有良好的抗腫瘤療效，有可能進一步提高B細胞淋巴瘤的臨床治愈率。

此外，在體內殺傷靶細胞過程中，抗CD19 CAR-T細胞與自免疫T細胞的激活會導致血清中免疫刺激細胞因子的增加，如Granzyme B、IL-6、IL-10、TNF-

α

、IFN-

γ

、IFN-

β

等，介導對腫瘤的殺傷作用。而這些細胞因子過度的級聯釋放會導致受試者發生細胞因子風暴，是CAR-T細胞療法的不良反應之一。研究表明金銀花提取物對細胞因子的調控是雙向的，它促進Granzyme B的分泌，而抑制IFN

-γ

與IL-10的釋放，對IL-2、TNF-

α

與IL-6的表達無顯著影響。Granzyme B是絲氨酸蛋白酶家族成員之一，常在效應T細胞中表達并介導對靶細胞的促凋亡作用，而金銀花提取物的處理促進了抗CD19 CAR-T細胞釋放Granzyme B，進一步揭示了金銀花與抗CD19 CAR-T細胞的聯合應用具有最佳腫瘤殺傷能力的原因；有研究表明干擾素IFN

-γ

水平的高低對CAR-T細胞的療效無顯著影響，并且抑制 IFN

-γ

不僅可以減輕細胞因子相關的毒性，還能夠通過減少免疫檢查點蛋白的表達來增強T細胞增殖，金銀花提取物的干預明顯抑制了抗CD19 CAR-T細胞分泌IFN

-γ

，說明金銀花可能會在不影響殺傷效果的同時減輕抗CD19 CAR-T細胞療法引發的CRS癥狀，也解釋了經金銀花處理的抗CD19 CAR-T細胞自我更新能力得到提高的原因。

PD-1是重要的免疫檢查點之一，當抗CD19 CAR-T細胞暴露于腫瘤細胞環境時，會誘導自身PD-1蛋白的表達上調，PD-1信號通路的激活則會降低抗CD19 CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性以及細胞增殖能力，導致腫瘤免疫逃逸的發生。而10 mg·mL金銀花提取物處理可以下調由Raji細胞刺激誘發的抗CD19 CAR-T細胞中PD-1的表達，這說明金銀花提取物有可能通過下調PD-1蛋白的表達從而增強抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷活性以及細胞增殖能力。

綜上，本項研究證實了金銀花提取物可以提高抗CD19 CAR-T細胞體外殺傷腫瘤的效力，且特異性調控細胞因子的釋放水平并下調免疫檢查點PD-1的表達。這一發現將有助于改善抗CD19 CAR-T細胞療法的效果與降低不良反應的發生率，也拓展了中藥金銀花的臨床應用范圍。然而，金銀花調控抗CD19 CAR-T細胞功能的有效成分與內在分子機制尚不清晰，有待中藥物質基礎學研究與生物信息學分析加以闡釋，為金銀花與抗CD19 CAR-T細胞聯合療法的臨床轉化提供更夯實的證據。