反相高效液相色譜法同時(shí)測定清瀉丸中8種成分的含量

蔣范任，王瑋，肖正賢，高洪琳，劉小芬，蔡洪鯤（.益陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 益陽 43000；2.益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南 益陽 43000）

清瀉丸是由大黃、黃芩、枳實(shí)、甘草、朱砂粉5 味中藥組成的成方制劑，收載于《中國藥典》2020年版一部，具有清熱、通便、消滯的作用，用于實(shí)熱積滯所致的大便秘結(jié)。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展，中藥質(zhì)量控制方法已有長足的進(jìn)步，其中化學(xué)成分的含量測定已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制的重要方法，并且由單一成分逐漸發(fā)展到對(duì)多種成分的含量進(jìn)行控制，通常采用高效液相色譜外標(biāo)法測定各成分的含量。目前，清瀉丸收載于《中國藥典》2020年版一部，藥典標(biāo)準(zhǔn)中僅有朱砂粉及蒽醌類成分大黃素和大黃酚的含量測定。為進(jìn)一步完善清瀉丸的質(zhì)量控制方法，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，建立了RP-HPLC 法同時(shí)測定清瀉丸中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

電子天平XSE205DU（Mettler Toledo，d ＝0.01 mg）；LC-20AT 高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測器，SIL-20A 進(jìn)樣器，日本島津）；KQ-300DE 中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品黃芩苷（批號(hào)：110715-202122，純度：94.2%）、漢黃芩苷（批號(hào)：112002-201702，純度：98.5%）、黃芩素（批號(hào)：111595-201808，純度：97.9%）、漢黃芩素（批號(hào)：PR160215-08，純度：100%）、大黃酸（批號(hào)：110757-201607，純度：99.3%）、大黃素（批號(hào)：110756-201913，純度：96.0%）、大黃酚（批號(hào)：110796-201922，純度：99.4%）、大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201817，純度：99.2%）（中國食品藥品檢定研究院）；清瀉丸（批號(hào)：A03055M、B03004M、B03014M、B03027M、B03009M、B03026M、B03023M，廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，規(guī)格：5.4 g/袋）；乙腈（色譜純）、甲醇（分析純）、磷酸（分析純）（美國Honeywell）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Luna C（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫[0 ～7 min（16%A），7 ～8 min（16% ～21%A），8 ～27 min（21% ～43%A），27 ～28 min（43% ～48%A），28 ～45 min（48%～77%A），45 ～46 min（77%～16%A），46 ～60 min（16%A）]；檢測波長：274 nm，流速：1.0 mL·min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為0.453、0.052、0.033、0.021、0.081、0.039、0.102、0.050 mg·mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1、2、3、5 mL 分別置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取供試品（批號(hào)：A03055M），粉碎，取0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲（功率200 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按清瀉丸制備工藝，制備不含大黃、黃芩及不含大黃和黃芩藥材的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣分析，以峰面積

Y

為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度

X

（μg·mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各對(duì)照品回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 各成分的線性關(guān)系考察結(jié)果
Tab 1 Linearity of each component

成分回歸方程r線性范圍/（μg·mL－1）黃芩苷Y ＝2.08×104X ＋6.64×102 0.9999 4.530 ～226.5漢黃芩苷Y ＝4.56×104X－8.04×102 0.9999 0.520 ～26.00黃芩素Y ＝4.61×104X－2.70×103 1.0000 0.330 ～16.50漢黃芩素Y ＝6.15×104X－3.03×103 0.9998 0.210 ～10.50大黃酸Y ＝2.30×104X－2.39×103 1.0000 0.810 ～40.50大黃素Y ＝7.93×104X－2.67×103 0.9999 0.390 ～19.50大黃酚Y ＝4.12×104X ＋1.68×103 1.0000 1.020 ～51.00大黃素甲醚 Y ＝3.75×104X－1.48×104 0.9999 0.500 ～25.00

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的

RSD

分別為0.54%、0.63%、0.83%、0.65%、0.66%、0.53%、0.75%、0.51%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)：A03055M），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在0、1、3、6、9、12、24、36、48 h 分別進(jìn)樣，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的

RSD

分別為0.64%、0.51%、0.94%、0.76%、0.62%、0.58%、0.72%、0.83%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)：A03055M）6 份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測定，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為18.16、1.991、1.175、0.586、2.922、1.235、3.610、1.531 mg·g，

RSD

值分別為1.5%、0.71%、1.3%、1.5%、0.90%、0.35%、0.49%、0.95%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 回收試驗(yàn)

取已知黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量分別為18.16、1.991、1.175、0.586、2.922、1.235、3.610、1.531 mg·g的供試品約0.15 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，精密加甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，制得加樣回收供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率（

n

＝6）分別 為99.1%、98.7%、101.2%、99.5%、101.0%、100.9%、99.0%、101.1%，

RSD

分 別 為1.3%、1.4%、1.1%、1.8%、1.0%、1.5%、1.8%、0.90%。

2.8 專屬性試驗(yàn)

分別取混合對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示陰性樣品色譜中，在與對(duì)照品及供試品色譜對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無相應(yīng)的色譜峰，表明方法專屬性良好，見圖1。

圖1 供試品（A）、混合對(duì)照品（B）、缺大黃陰性樣品（C）、缺黃芩陰性樣品（D）、總陰性樣品（E）溶液的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of sample（A），mixed reference（B），negative sample without Rhei Radix Et Rhizoma（C），negative sample without Scutellariae Radix（D）and negative sample（E）

2.9 耐用性試驗(yàn)

分別采用Luna C、Gemini-NX C、Kromasil C色譜柱，取供試品（批號(hào)：A03055M）按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，分別進(jìn)樣。用不同色譜柱記錄的色譜圖中待測組分的色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5。不同色譜柱測得供試品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均含量的

RSD

分別為0.25%、0.54%、1.2%、1.7%、0.96%、0.38%、0.70%、0.51%，結(jié)果表明色譜柱類型對(duì)含量測定結(jié)果影響較小。

2.10 供試品的含量測定

取7 批供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，平行測定3 次，記錄峰面積，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定(mg·g， ＝3)
Tab 2 Determination of sample (mg·g， ＝3)

樣品批號(hào)黃芩苷漢黃芩苷黃芩素漢黃芩素大黃酸大黃素大黃酚大黃素甲醚A03055M18.161.9911.1750.5862.9221.235 3.6101.531 B03004M14.671.7341.3330.7202.6501.2843.1661.464 B03014M18.232.1091.3980.7472.9691.3383.4671.545 B03027M17.861.8971.2050.5692.8921.199 3.6931.474 B03009M17.451.6911.2550.5462.7951.195 3.3761.501 B03026M18.071.8721.1440.6062.8121.267 3.5501.447 B03023M17.401.8901.2750.5972.8221.253 3.4211.486

3 討論

3.1 波長的選擇

通過二極管陣列檢測器（DAD）在200 ～400 nm 波長下掃描分析各成分的紫外光譜圖，結(jié)果顯示黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別在276、273、274、274、258、266、277、266 nm波長處有最大吸收，其中274 nm 處8 種成分的吸收峰高度接近，峰形較好，因此選用274 nm波長作為檢測波長。

3.2 提取溶劑的考察

分別考察用水、不同濃度的甲醇（10%、50%、75%、100%）和乙醇（10%、50%、75%、100%）等作為提取溶劑，超聲處理（200 W，40 kHz）30 min 的提取效果，發(fā)現(xiàn)用100%甲醇作為提取溶劑時(shí)各組分的含量最高，因此，選用100%甲醇作為提取溶劑能夠提取完全，且溶液的穩(wěn)定性較好。

3.3 提取方法的考察

分別采用超聲處理、浸置過夜、加熱回流1h，發(fā)現(xiàn)超聲處理、浸置過夜制得供試品中各組分含量均較加熱回流高，放置過夜處理供試品耗時(shí)長，而超聲處理（200 W，40 kHz）30 min，操作簡單，快速，方便，可以常溫操作，因此，超聲處理（200 W，40 kHz）30 min 作為該供試品的提取方法。

3.4 流動(dòng)相的選擇

采用梯度洗脫，分別考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-水等不同流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)甲醇-水、乙腈-水等不含酸系統(tǒng)部分組分的峰形不好，有拖尾現(xiàn)象，在含酸系統(tǒng)中能很好地分離并能改善無酸系統(tǒng)的拖尾現(xiàn)象，其中乙腈-0.1%磷酸較甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)柱壓低且出峰時(shí)間適中，因此該研究采用乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相。