鹽酸曲美他嗪原料藥中有關物質(zhì)測定方法的研究

楊西邈，孫國祥，產(chǎn)運霞（1.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016；.北京福元醫(yī)藥股份有限公司，北京 101104）

曲美他嗪（trimetazidine），化學名為1-（2，3，4-三甲氧基芐基）哌嗪，結(jié)構式見圖1，是近年來發(fā)現(xiàn)的抗心肌缺血藥物，可優(yōu)化心肌細胞的能量代謝，改善患者心功能，同時能抑制氧自由基，使缺血心肌細胞維持正?；顒?，在心力衰竭患者的治療中發(fā)揮著重要作用。本文根據(jù)合成工藝和降解機制，選擇9種主要的有關物質(zhì)A、B、C、D、E、F、H、J、K（結(jié)構見圖1），建立鹽酸曲美他嗪有關物質(zhì)的測定方法，并采用一線多評法對方法進行驗證和評估。為鹽酸曲美他嗪原料藥的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖1 曲美他嗪及有關物質(zhì)的化學結(jié)構式Fig 1 Chemical structures of trimetazidine and its related substances

1 材料

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（型號：LC-2010CHT及LC-20AT，日本島津公司）；電子分析天平（型號：MS105DU及ML204，梅特勒-托利多儀器有限公司）；pH酸度計（型號：FE20，梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（型號：DHG101-1A，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司）；藥品光照試驗箱（型號：SHH-300GD-2，重慶市永生試驗儀器廠）。

甲醇（色譜純，Burdick & Jackson）；庚烷磺酸鈉（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；氫氧化鈉（分析純，北京市光復科技發(fā)展有限公司）；磷酸、鹽酸、30%過氧化氫（分析純，北京化工廠）；鹽酸曲美他嗪對照品（批號：100889-201302，質(zhì)量分數(shù)99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；有關物質(zhì)A（批號：35069，質(zhì)量分數(shù)94.9%）、B（批號：35343，質(zhì)量分數(shù)99.7%）、C（批號：45715，質(zhì)量分數(shù)99.9%）、D（批號：41708，質(zhì)量分數(shù)99.0%）、E（批號：23180，質(zhì)量分數(shù)99.9%）、F（批號：27212，質(zhì)量分數(shù)99.2%）、H（批號：25681，質(zhì)量分數(shù) 98.2%）對照品（LGC），有關物質(zhì)J（批號：QM-6A01，質(zhì)量分數(shù) 96.7%）、K對照品（批號：QM-6A03，質(zhì)量分數(shù)99.6%）（北京福元醫(yī)藥股份有限公司）。鹽酸曲美他嗪原 料 藥（批 號：QM0171101、QM0171102和QM0171104，北京福元醫(yī)藥股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 稀釋溶液 以體積分數(shù)為40%的甲醇水溶液為稀釋溶液。取稀釋溶液作為空白對照溶液。

2.1.2 對照品溶液 取鹽酸曲美他嗪對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用稀釋溶液溶解并稀釋至刻度；精密量取1 mL置100 mL量瓶中，加稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 雜質(zhì)對照品定位溶液 分別精密稱取雜質(zhì)A～F、H、J和K對照品適量，用稀釋溶液溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度均為400 mg·L的溶液，即得。

2.1.4 雜質(zhì)混合溶液 精密量取上述各雜質(zhì)對照品定位溶液5 mL置同一250 mL量瓶中，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.5 系統(tǒng)適用性溶液 取鹽酸曲美他嗪對照品約40 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用適量稀釋溶液溶解，加入雜質(zhì)混合溶液5 mL，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.6 原料藥供試品溶液 取鹽酸曲美他嗪原料藥約40 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用稀釋溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件[11-12]

色譜柱為Phenomenex Gemini C柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.287%庚烷磺酸鈉溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2）-甲醇（體積比為643∶357）為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0～50 min，95%～75%A；50～52 min，75%～95%A；52～60 min，95%A）；流速為1.2 mL·min；檢測波長為240 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

2.3 方法學考察

分別取“2.1”項下空白對照溶液和系統(tǒng)適用性溶液進樣測定，記錄色譜圖。曲美他嗪峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于1.5，色譜圖見圖2。

圖2 空白對照溶液（A）和系統(tǒng)適用性溶液色譜圖（B）Fig 2 Chromatograms of blank control solution（A）and system suitability（B）

2.4 專屬性試驗

2.4.1 酸破壞試驗 取鹽酸曲美他嗪原料藥約200 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加1 mol·L鹽酸溶液5 mL，室溫放置24 h，加1 mol·L氫氧化鈉溶液5 mL中和，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 堿破壞試驗 取鹽酸曲美他嗪原料藥約200 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加1 mol·L氫氧化鈉溶液5 mL，室溫放置24 h，加1 mol·L鹽酸溶液5 mL中和，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 氧化破壞試驗 取鹽酸曲美他嗪原料藥約200 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液5 mL，60℃放置1 h，取出，放冷，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.4 高溫破壞試驗 取鹽酸曲美他嗪原料藥適量，置量瓶中，在105℃放置6 h，取出，放冷，精密稱取200 mg置50 mL量瓶中，用稀釋溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.5 光照破壞試驗 取鹽酸曲美他嗪原料藥適量，置透明量瓶中，在5000 lx條件放置5 d，取出，放冷，精密稱取200 mg置50 mL量瓶中，用稀釋溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

上述處理方法均平行配制空白對照溶液。將破壞后的樣品溶液和空白對照溶液分別進樣測定，色譜圖見圖3。鹽酸曲美他嗪在酸、堿、高溫和光照條件下穩(wěn)定性均良好，僅在氧化破壞條件下發(fā)生降解，所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物在選定的色譜條件下與主峰達到良好的分離，空白無干擾，說明該方法專屬性良好。

圖3 專屬性試驗降解產(chǎn)物HPLC色譜圖Fig 3 HPLC of destruction products of specificity test

2.5 線性關系考察

分別精密量取“2.1.4”項下雜質(zhì)混合溶液1、2、4、5、8、10、16 mL，置20 mL 量瓶中，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度約為0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0和6.4 mg·L的對照品溶液。將上述對照品溶液與“2.1.4”項下的雜質(zhì)混合溶液進樣測定，記錄色譜圖。以各成分質(zhì)量濃度（

C

，mg·L）為橫坐標，峰面積（

A

）為縱坐標，用加權最小二乘法進行線性回歸運算，得回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍見表1；采用一線多評法進行評估，結(jié)果見表2，可靠度

R

均大于96.2%，表明有關物質(zhì)A～F、H、J和K在質(zhì)量濃度0.4～8 mg·L與峰面積呈良好線性關系。

表1 有關物質(zhì)的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍結(jié)果
Tab 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of related substances

化合物 回歸方程 相關系數(shù)r 線性范圍/（mg·L－1）曲美他嗪 A＝7.719×103C－322.4 0.9999 0.408～8.160雜質(zhì)A A＝7.531×103C－200.5 1.0000 0.381～7.615雜質(zhì)B A＝1.235×104C－574.2 1.0000 0.469～9.386雜質(zhì)C A＝2.437×104C－699.4 1.0000 0.418～8.360雜質(zhì)D A＝4.973×103C＋100.5 1.0000 0.511～10.214雜質(zhì)E A＝1.086×104C－642.0 0.9999 0.397～7.944雜質(zhì)F A＝1.015×104C－6 09.4 0.9998 0.398～7.968雜質(zhì)H A＝9.793×103C－57.9 1.0000 0.451～9.022雜質(zhì)K A＝1.172×104C＋94.5 1.0000 0.457～9.137雜質(zhì)I A＝1.006×104C－334.0 1.0000 0.451～9.017

表2 有關物質(zhì)一線多評法各項參數(shù)值
Tab 2 Related substances by multi-markers assay by monolinear method

化合物 C0 bai＝a/C0 fi fsi RE（b）/% 1%bi f ''si 可靠度R（i）/%曲美他嗪 4.2840 75.2568 7794.26 1.0000 0.98 77.19 1.0000 －雜質(zhì)A 3.9980 50.1251 7581.13 1.0281 0.67 75.31 1.0250 96.45雜質(zhì)B 4.9275 116.5297 12 462.53 0.6254 0.95 123.46 0.6252 96.39雜質(zhì)C 4.3890 159.3529 24 532.35 0.3177 0.66 243.73 0.3167 96.45雜質(zhì)D 5.3625 18.7413 4991.74 1.5614 0.38 49.73 1.5522 96.50雜質(zhì)E 4.1705 153.9384 11 017.94 0.7074 1.44 108.64 0.7105 96.24雜質(zhì)F 4.1830 145.6610 10 298.66 0.7568 1.46 101.53 0.7603 96.23雜質(zhì)H 4.7365 12.2327 9805.23 0.7949 0.13 97.93 0.7882 96.51雜質(zhì)K 4.7970 19.6998 11 739.70 0.6639 0.17 117.20 0.6586 96.51雜質(zhì)J 4.7340 70.5534 10 132.55 0.7692 0.71 100.62 0.7671 96.45

2.6 重復性試驗

精密稱定同一批鹽酸曲美他嗪原料藥6份，每份約40 mg，按“2.1.6”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，按外標法和一線多評法分別計算有關物質(zhì)的含量，結(jié)果見表3，兩種方法計算結(jié)果差異小，結(jié)果表明方法重復性良好。

表3 有關物質(zhì)重復性試驗結(jié)果
Tab 3 Repeatability of related substances with different methods

序號 化合物峰面積 一線多評法/% 外標法/%雜質(zhì)A 雜質(zhì)B 未知雜質(zhì) 雜質(zhì)A 雜質(zhì)B 未知雜質(zhì) 雜質(zhì)A 雜質(zhì)B 未知雜質(zhì)1 2441 9725 1071 0.008 0.022 0.003 0.009 0.024 0.003 2 2802 9120 1112 0.010 0.020 0.004 0.010 0.022 0.004 3 2641 9463 1078 0.009 0.021 0.004 0.010 0.023 0.004 4 2459 9385 1142 0.009 0.021 0.004 0.009 0.023 0.004 5 2519 9757 1002 0.009 0.022 0.003 0.009 0.024 0.003 6 2223 8875 1155 0.008 0.020 0.004 0.008 0.022 0.004平均值 2514 9388 1093 0.009 0.021 0.004 0.009 0.023 0.004 RSD/%7.83.75.1－－－－－－

2.7 回收試驗

取鹽酸曲美他嗪原料藥9份，每份約80 mg，精密稱定，平均分成3組，分別置于20 mL量瓶中，每組分別加入雜質(zhì)混合溶液5、10和15 mL，用稀釋溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成相當于有關物質(zhì)限度質(zhì)量濃度50%、100%和150%的溶液，進樣測定，按加校正因子的主成分外標法和一線多評法計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 有關物質(zhì)回收試驗計算結(jié)果 (%)
Tab 4 Recovery of related substances with different methods (%)

化合物 一線多評法 外標法低中高 均值 RSD 低 中 高 均值 RSD雜質(zhì)A 102.0 101.6 100.4 101.3 1.1 102.5 102.1 100.9 101.8 1.1雜質(zhì)B 101.0 99.6 99.7 100.1 0.81 99.6 98.2 98.3 98.7 0.81雜質(zhì)C 97.1 97.4 97.8 97.4 0.96 98.7 99.1 99.5 99.1 0.96雜質(zhì)D 101.2 99.7 99.8 100.2 0.96 99.8 98.3 98.4 98.8 0.96雜質(zhì)E 105.1 102.6 105.0 104.2 1.3 100.9 98.6 100.8 100.1 1.3雜質(zhì)F 103.7 98.6 100.2 100.8 2.6 101.9 97.1 98.6 99.2 2.6雜質(zhì)H 102.9 103.4 103.2 103.1 0.65 98.6 99.0 98.8 98.8 0.65雜質(zhì)J 105.9 104.9 106.2 105.6 2.0 98.9 98.0 99.2 98.7 2.0雜質(zhì)K 98.0 97.9 97.2 97.7 1.2 102.5 102.1 100.9 101.8 1.2

2.8 穩(wěn)定性試驗

取鹽酸曲美他嗪對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用稀釋溶液溶解并稀釋至刻度；精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用適量稀釋溶液溶解，加入雜質(zhì)混合溶液50 mL，用稀釋溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對照品混合溶液。將此溶液在室溫下放置，分別于0、3、8、12、16、20 和24 h，分別按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄有關物質(zhì)A、B、C、D、E、F、H、J、K及曲美他嗪的色譜峰面積，計算

RSD

分別為1.5%、1.1%、1.0%、0.50%、0.60%、0.40%、1.1%、1.1%、1.3%和0.6%，表明對照品混合溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

取鹽酸曲美他嗪原料供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、3、8、12、16、20 和24 h，分別按“2.2”項下色譜條件進樣分析，樣品中均未檢出雜質(zhì)峰，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 樣品測定

取鹽酸曲美他嗪對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度使曲美他嗪的色譜峰高約為滿量程的20%，再取鹽酸曲美他嗪供試品溶液，進樣測定，3批樣品均未檢測到有關物質(zhì)。

3 討論

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，鹽酸曲美他嗪及各雜質(zhì)峰的保留時間容易隨室溫的變化而發(fā)生漂移，在試驗進行中應盡量控制實驗室的溫度，并使用柱溫控制效果較好的高效液相色譜儀進行分析。用加校正因子的主成分外標法和一線多評法分別計算重復性和回收率結(jié)果，結(jié)果表明兩種方法測定的有關物質(zhì)基本一致。為節(jié)省對照品用量，并減少標準曲線配制過程，同時使計算結(jié)果更加準確可靠，可采用一線多評法作為鹽酸曲美他嗪有關物質(zhì)的計算方法。