超高效液相色譜-串聯質譜法測定柴胡中4種成分的含量

郭宇鴿，柏玉冰，李洪權，胡冠羽，黎旭*（.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 40007；.長沙市第三醫院，長沙 4005；.株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 4000）

柴胡是傘形科（Apiaceae）植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根。其性味辛、苦，微寒，歸肝、膽、肺經，具有疏散退熱，疏肝升陽，升舉陽氣等功效[1]。柴胡主要含有皂苷[2]、揮發油[3]、黃酮[4]、多糖[5]、香豆素、多炔[6]等成分，具有解熱、調節免疫[7]、抗抑郁[8]、保肝[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]等作用。

目前，柴胡所有藥理作用中，研究最典型的是解熱作用。有研究認為，其作用成分主要為直接產生解熱作用的柴胡皂苷和揮發油以及通過抑制熱源而間接產生解熱作用的黃酮[12-13]。也有研究者認為，柴胡的傳統用藥方式為煎煮，此時，揮發油含量不足以達到解熱效果[14]，因此，柴胡發揮解熱作用的成分應該以柴胡皂苷和黃酮為主。而柴胡中各種柴胡皂苷和黃酮含量有差異，含量較高者為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、蘆丁以及槲皮素[15-17]。目前，關于同時測定含這4種成分含量的方法，只有液相色譜法[18]。而相對液相色譜法，具有信號采集時間短，選擇性強等優勢[19]的液相色譜-串聯質譜法尚未見報道。

本文基于超高效液相色譜-串聯質譜（UPLCMS/MS）法建立柴胡中4種成分的含量測定方法，以期更好地控制其質量。

1 材料

1.1 試藥

柴胡樣品源自于藥店、網商和藥材市場，信息見表1。所有批次藥材經株洲市食品藥品檢驗所胡冠羽主管藥師鑒定均為傘形科（Apiaceae）植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的段根。柴胡皂苷a（批號：110777-201711，純度：98.0%）、柴胡皂苷d（批號：110778-201711，純度：98.0%）、槲皮素（批號：100081-200907，純度：97.4%）和蘆丁（批號：10080-200707，純度：90.5%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

甲酸、乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，霍尼韋爾有限公司）。

1.2 儀器

XSE 205DV型電子天平（精度：0.01 mg，梅特勒托利多儀器有限公司）；HNS-SY-150型超聲波儀（北京恒奧德儀器儀表有限公司）；Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；QTRAP 4500型三重四極桿質譜（上海愛博才思分析儀器有限公司）等。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Welch Utimate AQ-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，以水（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，90%→55%A；5～10 min，55%→30%A；10～12 min，30%→10%A；12～12.5 min，10%→90%A；12.5～15 min，90%A），流速0.5 mL·min－1，采集時間15 min，柱溫30℃，進樣量5 μL。

2.1.2 質譜條件 質譜：電噴霧電離源（ESI），負離子掃描，多反應監測（MRM），離子源溫度：550℃，電噴霧電壓：－4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：55 psi，離子源氣2：55 psi，碰撞氣：氬氣。各成分的質譜參數見表2，準分子離子見圖1。

圖1 4種成分的準分子離子圖Fig 1 Excimer ion of 4 components

表2 4種成分的保留時間及質譜參數Tab 2 Retention time and UPLC-MS/MS parameters of the 4 components

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品儲備液 精密稱取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。經含量折算后，上述各對照品的質量濃度分別為1.0094、1.0388、0.983 74、0.977 40 mg·mL－1。對照品提取離子色譜圖見圖2A。

2.2.2 供試品溶液 取柴胡粉末（粉碎后過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，稱量，超聲（400 W，40 kHz）提取30 min，靜置至室溫，再稱量，用70%甲醇補足減失的量，搖勻，精密量取1 mL搖勻后的溶液，置于10 mL量瓶中，加入70%甲醇定容至刻度線，再次搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液，注入質譜儀進行分析。柴胡樣品提取離子色譜圖見圖2B。

圖2 柴胡混合對照品和樣品中分析物提取離子色譜圖Fig 2 Extracted ion chromatogram of Bupleurum chinense DC.mixture reference and sample

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取混合對照品儲備液適量，用70%甲醇稀釋得系列混合對照品溶 液（柴胡皂苷a：100.940、504.700、1009.40、2018.80、4037.60、5047.00 ng·mL－1；柴胡皂苷d：103.880、519.400、1038.80、2077.60、4155.20、5194.00 ng·mL－1；槲 皮 素：4.918 70、24.5935、49.1870、98.3740、196.748、245.935 ng·mL－1；蘆丁：122.175、610.875、122 1.75、244 3.50、488 7.00、610 8.75 ng·mL－1），進樣測定，以質量濃度X（ng·mL－1）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，計算4種成分的線性回歸方程，結果見表3，4種成分在各自線性范圍內呈良好的線性關系。

表3 線性關系結果(n＝6)Tab 3 Linear regression (n＝6)

2.3.2 精密度試驗 取混合對照品溶液，按照“2.1”項下條件連續進樣6次，記錄各成分峰面積并計算RSD。結果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為0.96%、0.79%、1.1%和1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批樣品（批號：CH20210314-1）6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄各成分峰面積并計算RSD。結果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為1.3%、1.3%、1.4%和1.2%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一批樣品供試品溶液（批號：CH20210314-1），分別于0、2、4、8和12 h進樣分析，記錄各成分峰面積并計算RSD。結果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為1.7%、2.0%、1.5%和1.7%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收試驗 取已知含量的樣品（批號：CH20210314-1）6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入絕對含量接近0.25 g藥材所含量的對照品溶液后，按“2.2.2”項下方法制備，進樣分析，計算加樣回收率，結果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁的平均加樣回收率為98.74%、97.96%、97.97%和98.41%，RSD均小于1.5%，表明本方法回收率良好。

2.4 樣品測定

精密稱取6批次不同批號的柴胡各2份，分別按照“2.2.2”項下方法制備，按照“2.1”項下條件進樣測定，代入線性回歸方程，計算4種成分的含量，結果見表4。

表4 6批次樣品的4種成分的含量(μg·g－1，n＝2)Tab 4 Contents of 4 components in 6 batches of samples(μg·g－1，n＝2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件優化

本研究比較了不同提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇），不同提取體積（20、30、40和50 mL），不同提取時間（10、20、30和40 min）對供試品溶液制備的影響，以4種成分的峰面積大小為判斷依據，確定最佳條件。結果，當甲醇濃度為70%，提取體積為30 mL，提取時間為30 min時，各成分峰面積均為最大值，因此選為最佳制備條件。

3.2 色譜條件優化

本研究比較了4種流動相組成（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含5 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液），4種C18色 譜 柱（Agilent Eclipse XDB、Thermo Acclaim 120、Welch Xtimate和Welch Utimate AQ，規格：4.6 mm×150 mm，5 μm），2種洗脫程序[乙腈-水（40∶60）等度洗脫和梯度洗脫（詳見本文色譜條件）]，3種流速（0.3、0.5和0.7 mL·min－1）。結果，流動相組成為甲醇-水溶液時，各成分的峰稍有拖尾現象，水相加入乙酸銨各成峰面積被抑制；加入乙腈-水，拖尾得到改善，峰寬較窄；加入甲酸，無明顯變化，因此，乙腈-水為最佳流動相組成。4種色譜柱均得到良好的峰形和分離度，但是Welch Utimate AQ柱相對其他色譜柱，各成分峰寬更窄，峰形更為尖銳，保留性更好，因此選為最合適色譜柱。洗脫程序中，等度洗脫時各成分峰形均有拖尾，換成梯度洗脫，峰形得到改善，因此選為最佳洗脫程序。流速為0.3和0.5 mL·min－1時，各成分峰形、峰面積相當；但是當流速為0.3 mL·min－1時出峰慢，不利于提高分析效率；當流速為0.7 mL·min－1時，各成分離子化不充分，峰面積變小，因此，選擇0.5 mL·min－1為最佳流速。

3.3 質譜參數的建立

通過比較正、負離子模式下各成分分子離子峰信號強度，選擇負離子模式；根據信號強度曲線，選擇各成分分子離子峰信號最強時所顯示數值；離子源溫度、電噴霧電壓、氣簾氣及離子源氣等參數則選擇儀器默認參數。

3.4 方法優劣比較

目前對柴胡中皂苷和黃酮成分進行定量分析的方法有多種，如HPLC-DAD（二極管陣列檢測器）、HPLC-ELSD（蒸發光散射檢測器）等。相對而言，本法優勢明顯，主要體現在快速、選擇性強等方面。如郭司群等[20]測定柴胡皂苷d的時長達到60 min，韋英杰等[18]同時測定柴胡中皂苷和黃酮成分的時長更是達到70 min，而本法只需15 min。另外，李衛斌等[21]測定柴胡皂苷含量時，柴胡皂苷c與雜峰分離不徹底，有部分重疊。韋杰英等[18]采用的方法中，柴胡皂苷a峰也與雜峰有重疊，影響到皂苷成分定性定量的準確性，而本法除色譜柱的分離功能，還可根據分析物的不同質荷比具有二次分離功能，專屬性強，干擾少。但是，本法設備比較昂貴，可能在前期投入和方法推廣方面不如上述方法。

3.5 總結

本研究建立了柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁4種成分的超高效液相-串聯質譜含量測定方法，為基于這4種成分對柴胡進行解熱的量效關系評價提供了研究基礎。