基于sfGFP系統的嫁接體接口處的細胞質融合檢測

李冬怡，鄧竹英，梁大成

(1.湖北省主要糧食作物產業化協同創新中心，湖北 荊州 434025；2.長江大學 濕地生態與農業利用教育部工程研究中心， 湖北省澇漬災害與濕地農業重點實驗室，湖北 荊州 434025)

嫁接是指把一株植物的枝或芽接到另一株植物的莖或根上，二者切口緊密連接共同生長，使接在一起的2個部分長成一個完整植株的技術[1]，嫁接的方法有多種，包括側接、舌接、劈接、剪接等[2]。嫁接作為一項技術手段廣泛應用于農業生產中，用來提高作物產量、改變植株分支結構、增強作物對生物和非生物脅迫的耐受性等[3-4]，同時也是研究參與基本生物過程的可移動蛋白、mRNA、小RNA的重要手段[5-8]。嫁接除了作為一項技術廣泛應用于農業生產和基礎研究外，嫁接體接口愈合機制的研究也十分重要。

嫁接體愈合機制的研究主要涉及創傷應急響應、愈傷組織形成、維管束重連、砧穗間的通訊、遺傳物質轉移等方面[9-11]。在嫁接體接口細胞互作及遺傳物質傳遞研究中，許多研究者認為，砧穗間僅蛋白質和RNA分子移動，并無遺傳物質交流，Stegemann等[12]、Fuentes等[13]、Gurdon等[14]和Bock[15]的研究證明，整個基因組可以在接穗和砧木間移動。Stegemann等[16]將在葉綠體中表達壯觀霉素抗性基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的轉基因普通煙草接穗嫁接到在細胞核中表達卡那霉素抗性基因和黃色熒光蛋白(YFP)基因的轉基因粉藍煙草砧木上，接口愈合后，截取嫁接體接口部位移至含有卡那霉素和壯觀霉素的培養基中，結果發現，被截取的接口部位能夠在培養基中長出愈傷組織，并生長出新植株，這表明砧穗間已發生遺傳信息的轉移。它們利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察到嫁接體中GFP和YFP熒光信號在同一細胞中表達，表明葉綠體基因組可以通過嫁接從一個物種傳遞到另一個物種。Lu等[17]的研究也證實了這一結論。前人的研究表明，植物細胞器的基因組參與嫁接體植物間水平基因組轉移，但并不清楚基因組是如何從一個細胞移至另一個細胞，以及它們是作為游離DNA分子還是包裹在細胞器中移動。Hertle等[18]為探究嫁接體接口處葉綠體在細胞間的移動機制，將Pt-spec∶dsRed接穗嫁接到Nuc-kan∶YFP砧木上，利用共聚焦顯微鏡觀察不同時期嫁接體接口處愈傷組織切片，發現砧穗間愈傷組織開始黏附時就已出現葉綠體的移動，葉綠體在砧穗間的移動可能發生在維管束重連之前。且利用透射電鏡觀察到，嫁接體接口愈傷組織形成初期，細胞壁會形成大孔，細胞質中的物質通過這些孔轉運到相鄰細胞，證實細胞器可以在細胞間移動，表明遺傳物質可能是被包裹在細胞器中移動的。

目前，綠色熒光蛋白(GFP)、黃熒光蛋白(YFP)和紅熒光蛋白(RFP)作為熒光標簽多被用在嫁接體愈合機制的研究中[16-18]，本研究中用到自組裝拆分的超折疊綠色熒光蛋白(sfGFP)系統。sfGFP可拆分為2個片段，分別為sfGFP1-10和GFP11。這2個單獨的片段是非熒光的，因為GFP11中保守的E222殘基對于發色團的成熟至關重要，一旦它們鄰近存在，2個片段就會重組成β桶狀結構并發出熒光[19]。前人利用自組裝拆分的sfGFP系統進行亞細胞定位的研究有很多，Van Engelenburg等[20]利用自組裝拆分的sfGFP系統對沙門氏菌直接分泌的三型效應物(T3E)進行了監測。Park等[21]基于改進的sfGFP1-10優化了自組裝拆分的sfGFP系統，提高sfGFP1-10片段的溶解度，增強GFP熒光強度，以監測丁香假單胞桿菌三型效應因子(T3Es)在植物細胞中的亞細胞定位。sfGFP系統還被用來研究哺乳動物蛋白的亞細胞定位[22]以及可視化通過T4SS傳遞的農桿菌VirE2進入植物細胞的過程[23]。目前，sfGFP系統還未被用在嫁接體愈合機制研究中。本研究構建了在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的轉基因擬南芥和在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的轉基因煙草植株，嫁接后利用激光共聚焦顯微鏡觀察接口處GFP熒光信號，檢測嫁接體接口處細胞質的融合發生事件。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(Col-0)和野生型本生煙草(Nicotianabenthamiana)均由長江大學農學院濕地作物微嫁接實驗室提供，轉化所用根癌農桿菌GV3101由本實驗室制作保存。試驗所需分別帶有基因sfGFP1-10和mCherry-11靶向細胞質的質粒CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11由美國加州大學生命科學學院植物生物學系和基因組中心Park Eunsook博士提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥的遺傳轉化 將質粒CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11分別轉入農桿菌感受態細胞GV3101，轉化后的農桿菌GV3101涂布于LB固體平板(含卡那霉素、利福平和慶大霉素)上，28 ℃培養2 d，挑取單菌落于LB液體培養基(含卡那霉素、利福平和慶大霉素)中，28 ℃ 250 r/min搖菌48 h后，取1 mL菌液擴繁培養。6 000 r/min 10 min收集菌體，重懸于侵染液(5%的蔗糖、0.05%的 SilwetL-77)，使OD600≈0.8。將野生型擬南芥Col-0的花苞分別浸泡在CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11的侵染液中1 min左右，暗處生長2 d后正常培養，10 d后進行二次侵染，成熟后收取的擬南芥種子即為T0種子，在含潮霉素的MS培養基中篩選生長健康的單株并種植于土壤中，再收獲得到T1種子。

1.2.2 煙草的遺傳轉化 按1.2.1方法得到CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11的擴繁菌液。83 r/s 5 min收集菌體，重懸于侵染液(液體MS培養基、100 μm AS)，使OD600≈0.5。將在無菌條件下生長28 d左右的野生型本生煙(Nicotianabenthamiana)葉片剪成圓片形狀，浸泡于侵染液中2 min，用鑷子取出葉片放在無菌濾紙上吸干表面殘留液體，放到含無菌濾紙的固體MS培養基(含100 μm AS和1 mg/L 6-BA)上，28 ℃黑暗條件下共培養2 d，移至新的固體MS培養基(含1 mg/L 6-BA、200 mg/L 頭孢噻肟、250 mg/L 特美汀和50 mg/L 潮霉素)中，28 ℃ 黑暗條件下生長7 d轉移到光照條件下生長，待愈傷長出煙草后移至生根培養基(含1 mg/L NAA、200 mg/L 頭孢噻肟、250 mg/L 特美汀和50 mg/L 潮霉素)中。長出根系的煙草移至土壤里種植，成熟后收獲得到T1種子。

1.2.3 嫁接體構建 將在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的轉基因擬南芥T1種子和在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的轉基因煙草T1種子播種在MS培養基(含潮霉素)中，8 d后，選取生長健壯的擬南芥(At-1-10、At-11)和煙草(Nb-1-10、Nb-11)幼苗作為嫁接材料。將在細胞質中表達sfGFP1-10的轉基因擬南芥接穗嫁接到在細胞質中表達mCherry-11的轉基因煙草砧木上構建遠緣嫁接體At-1-10/Nb-11，將在細胞質中表達sfGFP1-10的轉基因擬南芥幼苗接穗嫁接到在細胞質中表達mCherry-11的轉基因擬南芥砧木上構建自體嫁接體At-1-10/At-11，將在細胞質中表達sfGFP1-10的轉基因煙草接穗嫁接到在細胞質中表達mCherry-11的轉基因煙草砧木上構建自體嫁接體Nb-1-10/Nb-11。同時構建3組對照嫁接體：At-11/Nb-11、At-11/At-11、Nb-11/Nb-11。

1.2.4 共聚焦激光顯微鏡觀察 在嫁接后第4天，制作嫁接體徒手切片以及在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的轉基因擬南芥未嫁接單株和在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的轉基因煙草未嫁接單株的徒手切片，利用徠卡TCS SP8共聚焦顯微鏡觀察切片的GFP熒光信號(GFP熒光信號的觀察選擇488 nm激光波長進行激發)。

2 結果與分析

2.1 擬南芥、煙草轉化后代篩選及嫁接體的構建

選取MS固體培養基(含潮霉素)中生長健壯的T1轉基因擬南芥幼苗(圖1-A、B)和T1轉基因煙草幼苗(圖1-C、D)作為嫁接材料，成功構建嫁接體At-1-10/Nb-11、At-1-10/At-11 和Nb-1-10/Nb-11(圖1-E—G)，在嫁接后第4天，制作嫁接體及T1轉基因擬南芥和煙草未嫁接幼苗的徒手切片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號。

2.2 sfGFP系統可視化擬南芥/擬南芥嫁接體接口處細胞質的融合

用共聚焦顯微鏡觀察發現，在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的未嫁接擬南芥幼苗At-1-10和At-11以及嫁接體At-11/At-11中均無GFP信號的表達(圖2-A—C)。在擬南芥自體嫁接體At-1-10/At-11接口處觀察到GFP信號，出現的GFP信號多聚集在接口處，少量移動到接穗和砧木部位(圖2-D)。結果表明，在嫁接后第4天，擬南芥自體嫁接體砧穗間已經發生了細胞質的融合。嫁接體接口愈合過程中，擬南芥接穗中靶向細胞質的sfGFP1-10和砧木中靶向細胞質的mCherry-11重組成sfGFP發出熒光。因此，自組裝拆分的sfGFP系統可用于監測擬南芥自體嫁接體接口處細胞質的融合。

圖1 轉基因擬南芥與煙草及構建的嫁接體Fig.1 Transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana benthamiana plants and constructed grafts

圖2 轉基因擬南芥單株及擬南芥/擬南芥嫁接體GFP信號觀察Fig.2 GFP signal observation of transgenic Arabidopsis thaliana plants and At/At grafts

2.3 sfGFP系統可視化煙草/煙草嫁接體接口處細胞質的融合

為了探究煙草自體嫁接體接口細胞質的融合情況，用共聚焦顯微鏡觀察了在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的未嫁接煙草幼苗Nb-1-10和Nb-11以及煙草自體嫁接體Nb-11/Nb-11和Nb-1-10/Nb-11。結果發現，未嫁接煙草幼苗Nb-1-10和Nb-11以及煙草自嫁接體Nb-11/Nb-11中無GFP熒光信號(圖3-A—C)，而在煙草自體嫁接體Nb-1-10/Nb-11的接口處觀察到GFP信號，且有部分熒光信號轉移到接穗和砧木中，聚集在維管部位(圖3-D)。

2.4 sfGFP系統可視化擬南芥/煙草嫁接體接口處細胞質的融合

利用sfGFP系統識別擬南芥自體嫁接體和煙草自體嫁接體接口處細胞質融合的方法是可行的，為進一步監測遠緣嫁接體細胞質融合情況，將在細胞質中表達sfGFP1-10的擬南芥接穗嫁接到在細胞質中表達mCherry-11的煙草砧木上構建遠緣嫁接體At-1-10/Nb-11。在嫁接后第4天，用共聚焦激光顯微鏡觀察發現，對照嫁接體At-11/Nb-11中無GFP信號(圖4-A)，擬南芥與煙草的遠緣嫁接體At-1-10/Nb-11接口處檢測到GFP信號，拆分的sfGFP片段在接口處重組后移動到接穗部位，大量聚集在接穗維管束周圍(圖4-B)。

圖3 轉基因煙草單株及煙草/煙草嫁接體GFP信號觀察Fig.3 GFP signal observation of transgenic Nicotiana benthamiana plants and Nb/Nb grafts

圖4 擬南芥/煙草嫁接體GFP信號觀察Fig.4 GFP signal observation of At/Nb grafts

2.5 遠緣嫁接與自體嫁接接口處細胞質融合差異

為了比較自體嫁接體與遠緣嫁接體在細胞質融合上的差異，用LAS AF Lite統計嫁接體接口處及附近部位的GFP熒光表達量，結果發現，在嫁接后第4天，擬南芥和煙草的遠緣嫁接體At-1-10/Nb-11的GFP熒光強度顯著強于自體嫁接體At-1-10/At-11和Nb-1-10/Nb-11(P<0.05)，且擬南芥自體嫁接體的熒光強度顯著強于煙草自體嫁接體(P<0.05)(圖5)。

不同小寫字母表示數據之間存在顯著差異(P<0.05)。 Different lowercase letters indicated significant differences between the data(P<0.05).

3 結論與討論

Stegemann等[16]、Lu等[17]和Hertle等[18]的研究表明，嫁接可以使葉綠體基因組跨越物種屏障，且葉綠體能夠在砧穗間移動，它們在試驗中將GFP、YFP和RFP作為標簽對嫁接體接口細胞器的移動進行監測追蹤。本研究利用拆分的sfGFP系統可視化自體嫁接與遠緣嫁接細胞質融合的方法更直觀簡便，省去雙抗性培養基篩選愈傷組織的過程，構建了在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和sfGFP11的轉基因擬南芥和在細胞質中單獨表達sfGFP1-10和sfGFP11的轉基因煙草植株，嫁接后利用共聚焦顯微鏡觀察嫁接體接口處是否存在GFP熒光信號，以此判斷接穗與砧木接口處細胞間細胞質是否發生融合。結果表明，在嫁接后第4天，自體嫁接與遠緣嫁接體接口處細胞質已經發生融合，遠緣嫁接體與自體嫁接體接口處的GFP信號都向嫁接體接穗和砧木部位發生不同程度的轉移，大量聚集在維管束附近，這與Hertle等[18]和Melnyk等[24]的結論一致，推測細胞質的融合發生在維管束重連(3 DAG)之前，可能在嫁接后短時間內接口處就產生了細胞質融合；同時發現，遠緣嫁接體發生的細胞質融合程度遠強于自體嫁接，這可能與物種間不親和性有關，遠緣物種在嫁接愈合過程中接口處細胞間的識別以及維管束的變化是劇烈的[25]，為響應這一系列劇變，可能導致遠緣嫁接體砧穗間細胞器的融合及移動發生時期更早，且強度強于自體嫁接體，具體原因尚需進一步研究。本研究僅觀察了在嫁接后第4天嫁接體接口處細胞質融合情況，尚不清楚接口處細胞質是從何時開始融合轉移的。為進一步探究嫁接體砧穗間細胞器的融合互作機制，在本研究的基礎上，可以構建在細胞核、葉綠體和線粒體等細胞器單獨表達sfGFP1-10和mCherry-11的轉基因擬南芥和煙草植株，分別在嫁接后第3天、嫁接后第2天、嫁接后1天甚至嫁接后更短時間內觀察接口處的熒光表達情況。

目前，砧穗間細胞互作相關研究還處于初級階段，尚未弄清接口處細胞間細胞器是如何融合移動的。本研究將sfGFP系統應用于研究砧穗間細胞互作的方法是新穎的，利用這種自組裝拆分sfGFP系統的發光機制，可視化嫁接體接口處細胞質的融合，證實了sfGFP系統在嫁接體愈合機制研究中的可行性，為研究嫁接體接口處細胞學事件提供了新思路和方法。