PAI-1 招募中性粒細(xì)胞調(diào)控IL-6/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的肺細(xì)胞損傷

竇懋森，金文婷，宋元林，潘 玨*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科，上海 200032

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200032

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）主要表現(xiàn)為由各種局部和全身性損傷引起的呼吸衰竭，后期可發(fā)展為多器官功能衰竭［1］。盡管保護(hù)肺部的呼吸機(jī)策略已獲得較好進(jìn)展并改善了ALI/ARDS 預(yù)后，但由于缺乏有效的治療手段和對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的了解不足，ALI/ARDS 患者病死率仍很高［2］。因此，闡明誘發(fā)肺損傷的分子機(jī)制對(duì)于尋找新的診治靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)臨床治療方法非常重要。

ALI/ARDS 患者常伴肺泡-毛細(xì)血管屏障高通透性導(dǎo)致的肺水腫和動(dòng)脈氧合受損。此外，肺組織中大量炎癥因子積聚和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)也是其主要分子特征［3-4］。當(dāng)細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 引 起ALI 時(shí)， 中 性粒細(xì)胞會(huì)被激活并被招募到肺泡間隙及肺組織中釋放活性氧、中性粒細(xì)胞趨化因子、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等物質(zhì)［1,4-5］。這些物質(zhì)雖然能對(duì)抗外來(lái)入侵的病原體，但過(guò)量釋放時(shí)也會(huì)損傷肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。用普樂(lè)沙福（AMD3100，CXCR4 拮抗劑）、阿法鏈道酶（pulmozyme，人重組DNA 酶）或西維來(lái)司他（sivelestat，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑）抑制中性粒細(xì)胞的活化和募集則能緩解感染相關(guān)ALI/ARDS 癥狀［6］。因此，中性粒細(xì)胞的招募對(duì)ALI/ARDS 的發(fā)生發(fā)展起重要作用，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍不明確。

纖溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是一種相對(duì)分子量為52 000 的糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員。PAI-1 能通過(guò)與靶蛋白酶相互作用來(lái)調(diào)節(jié)凝血和纖維蛋白溶解。生理情況下，PAI-1 能與組織型纖溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）結(jié)合而使之滅活［7-8］。研究［9］表明ARDS 患者炎癥和凝血系統(tǒng)之間存在交叉聯(lián)系，并提出了“免疫血栓”的觀點(diǎn)。另有臨床試驗(yàn)［10］結(jié)果顯示，血漿PAI-1 是影響ARDS 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，PAI-1 可能調(diào)節(jié)以中性粒細(xì)胞為中心的炎癥過(guò)程，并進(jìn)一步影響ALI/ARDS 的發(fā)展和預(yù)后。本研究利用LPS 誘導(dǎo)的損傷原代肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial type Ⅱ cell, AEC Ⅱ）為模型，闡釋PAI-1 能否通過(guò)趨化中性粒細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)肺損傷過(guò)程及基本機(jī)制，為臨床更好地認(rèn)識(shí)ALI/ARDS 和開(kāi)發(fā)相關(guān)治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 PAI-1 基因擴(kuò)增正向引物 為 5＇-CGCGGATCCGCGATGGACTACAAGG ACGACGATGACAAGCAGATGTCTCCAGCCC TC-3＇；反向引物為 5＇-CCGCTCGAGCGGTCAGG GTTCCATCACTTGGCCCATGAAAAG-3＇， 酶 切位點(diǎn)為BamHI 和XhoI，擴(kuò)增 25 個(gè)。Flag(N＇-DYKDDDDK-C＇)位 于PAI-1 的N 端。 隨 后，PAI-1片段被克隆到pcDNATM3.1(+)形成pcDNA3.1-Flag PAI-1（Invitrogen 公 司 ）， 并 進(jìn) 行 DNA 測(cè)序。HEK293T 由天津市中醫(yī)藥研究院饋贈(zèng)，加入 含 有 10%FBS（Hyclone 公 司） 及 50 g/L 青 霉素/鏈霉素的DMEM（Corning 公司）培養(yǎng)基中，在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前 1 d，將5.0×105個(gè)細(xì)胞接種到6 孔板，當(dāng)密度達(dá)75%時(shí)，用 lipofectamine 2000（Invitrogen 公司）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建表達(dá)載體。第2 天用LPS 處理轉(zhuǎn)染的HEK293T 細(xì)胞，觀察Flag-PAI-1 是否被激活。

1.2 AEC Ⅱ的分離和培養(yǎng) Sprague Dawley 大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，均予以常規(guī)飲食。于80～90 日齡（最適交配時(shí)間）時(shí)將雄性和雌性大鼠合籠，最終獲得懷孕19 d 大鼠，取出胎鼠。在超凈工作臺(tái)中，用75%乙醇對(duì)仰臥位固定的胚胎進(jìn)行消毒［11-12］。在胸線中線處，用眼科彎鉗沿橫膈膜切開(kāi)肋骨，暴露胸腔，用另一把無(wú)菌眼科彎鉗肘部末端迅速取出肺組織，將肺放在含有鏈霉素和氨芐青霉素的PBS 培養(yǎng)皿中。用PBS 沖洗肺組織以洗凈血跡，用直眼剪刀將肺組織粗略地剪成 1～3 mm 的組織片。用 5～8 倍體積的胰蛋白酶、在37℃水浴條件下消化肺組織片10～15 min。加入含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止胰蛋白酶反應(yīng)，3 000×g 離心 10 min，去除多余的上清液。用含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到10 cm 培養(yǎng)皿里，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 中性粒細(xì)胞分離和純化 提取6～8 周齡Sprague Dawley 大鼠 5 mL 全血，抗凝。嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明將血液緩慢加入中性粒細(xì)胞分離液（P9200，Solarbio）的上層，室溫下500×g 離心35 min。離心后小心吸取中性粒細(xì)胞層并用10 mL PBS 洗滌細(xì)胞，250×g 離心 10 min，棄上清，細(xì)胞重懸備用。

1.4 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞存活率 采用不同濃度（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/mL） 的 LPS 處理HEK293T 細(xì)胞 6 h，以確定LPS 最適濃度。用DMSO、LPS（最適濃度）或LPS（最適濃度）＋PAI-039（10 μmol/L）處理 AEC Ⅱ 6 h 后，收集細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將1×105個(gè)AEC Ⅱ加入96 孔板中，分別于培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h 時(shí)加入含有10% CCK8（ab228554，Abcam 公司）的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下孵育3 h，在450 nm 處測(cè)量吸光度。PAI-039（HY-15253）為PAI-1抑制劑，購(gòu)自MCE 公司。

1.5 ELISA 檢測(cè) PAI-1（大鼠中以PAI-1A 表示）重組蛋白加入中性粒細(xì)胞培養(yǎng)基中，采用大鼠ELISA 試劑盒，分別檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α；ab236712, Abcam）、白細(xì)胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β；ab255730,Abcam 公司）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6；ab234570, Abcam 公 司 ）、MPO（E4581，BioVision 公 司 ）、MMP-1（ml002968, Mlbio 公司）和血小板/內(nèi)皮黏附因子（platelet/endothelial cell adhesion molecule，PECAM；ab213175, Abcam公司）。將中性粒細(xì)胞懸浮在上層小室中，用DMSO、LPS 或 LPS+PAI-039 處理下層 AEC Ⅱ 2 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，1 000×g 離心 5 min 獲得上清液，用ELISA 試劑盒分別檢測(cè)IL-6、MMP-1 和MPO 的含量。

1.6 中性粒細(xì)胞遷移試驗(yàn)（Transwell） 采用5 μm 孔徑的聚碳酸酯膜 Transwell 小室（Corning公司），在上層小室中加入5×104個(gè)中性粒細(xì)胞，使其懸浮在無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基中（美侖公司）；在下層培養(yǎng)皿中加入2×105個(gè)AEC Ⅱ，分別用 DMSO、LPS 或 LPS+PAI-039 處理 2 h。收集遷移到下層小室的中性粒細(xì)胞并計(jì)數(shù)。去除上室后，AEC Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)在室溫下孵育5 min，對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色，在顯微鏡下對(duì)臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算其所占比例。

1.7 免疫印跡試驗(yàn) 用細(xì)胞刮收集處理好的細(xì)胞，加入RIPA 緩沖液于冰上裂解30 min，4℃，12 000 ×g 離心 15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到 1 個(gè)新的離心管中，加入4×SDS 上樣緩沖液，100℃，加熱10 min。通過(guò)SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)樣 品， 將 蛋 白 質(zhì) 轉(zhuǎn) 移 到 0.22 μm 厚 的 PVDF 膜（Millipore 公司）。該膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，用特異性抗PAI-1（ab222754，Abcam 公司）、Flag（F3165, Sigma 公司）、磷酸化 STAT3（Tyr705；9145, Cell Signaling Technology 公 司 ）、 磷 酸 化STAT3（Ser727；9134, Cell Signaling Technology公司）、STAT3（30835, Cell Signaling Technology公司）、Actin（66009-1-Ig, Proteintech 公司）抗體于4℃孵育過(guò)夜。隔日，吸除液體，TBST 清洗3 次，每次間隔 15 min，然后加入HRP 結(jié)合的親和山羊抗兔IgG（H＋L；SA00001-2, Proteintech公司）和HRP 結(jié)合的親和山羊抗鼠IgG（H＋L；SA00001-1, Proteintech 公司）室溫孵育 1 h，TBST清洗3次，每次間隔15 min，使用ECL發(fā)光液顯影。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 Graphpad Prism 5.0 分析數(shù)據(jù)，以x±s 表示，并采用雙尾非配對(duì)t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 LPS 對(duì) AEC Ⅱ 的 PAI-1 的 激 活 和 促 分 泌作 用 CCK8 結(jié) 果（圖 1A） 顯 示，LPS 刺 激HEK293T 細(xì) 胞 的 IC50 為 0.1 μg/mL。 免 疫 印 跡法結(jié)果顯示，外源性PAI-1 蛋白在HEK293T 細(xì)胞中成功表達(dá)（圖1B）；與PBS 對(duì)照組相比，LPS處理組HEK293T 細(xì)胞中PAI-1 表達(dá)量增加（圖1C）；LPS 處理后，PAI-1 蛋白能被偶聯(lián)Flag 抗體的蛋白A/G 磁珠從培養(yǎng)基中純化出來(lái)（圖1D）。

CCK8 結(jié)果（圖1E）顯示，與PBS 對(duì)照組相比，LPS 刺激后，AEC Ⅱ的活力顯著降低。免疫印跡法結(jié)果（圖1F）表明，LPS 處理后，AEC Ⅱ中PAI-1 蛋白表達(dá)量顯著增加。ELISA 結(jié)果（圖1G）表明，LPS 處理后，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的PAI-1 增加（P＜0.01）。

圖1 LPS 對(duì)AEC Ⅱ細(xì)胞的PAI-1 的激活和分泌作用

2.2 PAI-039 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞中PAI-1活化的抑制作用 免疫印跡法結(jié)果表明，與DMSO對(duì)照組相比，PAI-039 能顯著抑制AEC Ⅱ中PAI-1的表達(dá)（圖2A）及LPS 誘導(dǎo)AEC Ⅱ中PAI-1 的表達(dá)（圖2B）。ELISA 結(jié)果（圖2C）顯示，PAI-039顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的PAI-1 蛋白分泌（P＜0.01）。

圖2 PAI-039 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ中PAI-1 激活和分泌的抑制作用

2.3 PAI-1 招募中性粒細(xì)胞對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷的促進(jìn)作用 CCK8 結(jié)果（圖3A）表明，PAI-1 顯著增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的活力（P＜0.01）。Transwell 結(jié)果（圖3B、3C）表明，PAI-1 重組蛋白能促進(jìn)更多的中性粒細(xì)胞遷移到下層小室（P＜0.01）；LPS 處理組有更多的中性粒細(xì)胞遷移到下層小室（P＜0.01）；PAI-039 能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞遷移（P＜0.01）。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果（圖3D）表明，PAI-039 能顯著減少LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ的死亡（P＜0.001）。

圖3 PAI-1 招募中性粒細(xì)胞對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷的促進(jìn)作用

2.4 PAI-039 對(duì)IL-6 分泌的抑制作用 ELISA 結(jié)果（圖4A）表明，中性粒細(xì)胞培養(yǎng)基中加入PAI-1重組蛋白后，促炎癥細(xì)胞因子IL-6 升高顯著（P＜0.01），MPO 和MMP-1 水平也升高（P＜0.05）。ELISA 結(jié)果（圖4B）表明，LPS 處理后，AEC Ⅱ中IL-6 水 平 升 高（P＜0.001），MPO 和MMP-1水平升高（P＜0.05）；加入PAI-039 后，LPS 誘導(dǎo)的IL-6、MPO 和MMP-1 水平升高被逆轉(zhuǎn)。

圖4 PAI-039 對(duì)IL-6 分泌的抑制作用

2.5 抑制 PAI-1 或 STAT3 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 AEC Ⅱ細(xì)胞損傷的減輕作用 免疫印跡法結(jié)果（圖5A、5B）顯示，與DMSO 對(duì)照組相比，LPS 處理后，AEC Ⅱ中STAT3 Tyr705 磷酸化水平顯著升高，Ser727 磷酸化變化不明顯；PAI-039 和AZD1480（JAK2 抑制劑）顯著逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞中STAT3 Tyr705 磷酸化水平的升高。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果（圖5C）表明，AZD1480 能改善LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷（P＜0.01）。

圖5 抑制PAI-1 或STAT3 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷的減輕作用

3 討 論

目前，纖維蛋白溶解和凝血系統(tǒng)與炎癥系統(tǒng)之間的交互影響被證明在ALI/ARDS 的發(fā)生發(fā)展、嚴(yán)重程度和預(yù)后方面起重要作用［9］，但是這2 個(gè)系統(tǒng)如何影響ALI/ARDS 患者的肺損傷，尤其是分子機(jī)制目前尚不明確。PAI-1 為纖維蛋白溶解和凝血系統(tǒng)的重要成員，與炎癥系統(tǒng)共同影響ALI/ARDS的進(jìn)展。本課題組既往研究［10］發(fā)現(xiàn)PAI-1 招募中性粒細(xì)胞富集，進(jìn)而促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷，提示血漿中的PAI-1 水平升高與ALI/ARDS 的不良預(yù)后有關(guān)。PAI-1 主要在內(nèi)皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)且表達(dá)量較低，在缺氧、氧化應(yīng)激和LPS 誘導(dǎo)的炎癥刺激等不同條件下表達(dá)量增加［13-14］。本研究中，采用LPS 刺激表達(dá)Flag-PAI-1 的HEK293T 細(xì)胞，初步證明LPS刺激能促進(jìn)PAI-1 的表達(dá)及釋放。進(jìn)一步探討PAI-1 在用LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷中發(fā)揮的作用和分子機(jī)制，結(jié)果表明，在LPS 刺激下，PAI-1 被激活并分泌到AEC Ⅱ的細(xì)胞培養(yǎng)液中，而PAI-039作為PAI-1 抑制劑，能阻斷PAI-1 的激活和分泌，減輕LPS 誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷。該結(jié)果提示PAI-1是LPS 誘導(dǎo)肺部損傷的重要一環(huán)，而抑制PAI-1 可能成為ALI/ARDS 的潛在臨床治療方法。

Kwak 等［14］表明，中性粒細(xì)胞暴露于LPS 時(shí)被激活，而PAI-1 能通過(guò)激活JNK 來(lái)增強(qiáng)該效果，提示PAI-1 能招募中性粒細(xì)胞并促進(jìn)其遷移到ALI/ARDS 患者的肺組織中，從而促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的肺損傷。隨后，該課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PAI-1 明顯抑制了中性粒細(xì)胞的凋亡和胞葬作用［15］，與Zmijewski的研究［16］相一致，說(shuō)明PAI-1 可能作為一個(gè)“不要吞噬我”的信號(hào)來(lái)調(diào)控中性粒細(xì)胞。本研究中，PAI-1 重組蛋白明顯抑制了中性粒細(xì)胞的死亡，同時(shí)能阻斷中性粒細(xì)胞的激活和遷移，與上述研究一致。當(dāng)AEC Ⅱ暴露于LPS 時(shí)，更多的中性粒細(xì)胞被招募到AEC Ⅱ細(xì)胞培養(yǎng)基中，此外，PAI-039 逆轉(zhuǎn)了PAI-1 對(duì)LPS 激活中性粒細(xì)胞的增強(qiáng)作用，進(jìn)一步證明PAI-1 是中性粒細(xì)胞招募的一個(gè)關(guān)鍵因素。對(duì)損傷的AEC Ⅱ進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，PAI-039 抑制了LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞死亡。

既往研究［17-18］表明，當(dāng)肺細(xì)胞被LPS 感染時(shí)，被招募的中性粒細(xì)胞會(huì)分泌促炎癥因子，增加血管通透性，從而促進(jìn)肺損傷。本研究在中性粒細(xì)胞中加入PAI-1 重組蛋白，ELISA 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-6 升高顯著，由此推測(cè)IL-6 可能是PAI-1 激活中性粒細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷的關(guān)鍵炎癥因子。既往研究［19-21］表明，血清中IL-6 水平升高明顯加重肺部炎癥和纖維化，并導(dǎo)致ALI/ARDS預(yù)后變差。JAK 可以介導(dǎo)STAT3 的激活，從而干擾先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動(dòng)［22］；而且，在LPS 誘導(dǎo)的ALI 肺組織中STAT3 的磷酸化水平升高，與TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎癥細(xì)胞因子有關(guān)［23］。本研究中，由PAI-1 招募的中性粒細(xì)胞中JAK 介導(dǎo)的 STAT3 Tyr705 位點(diǎn)（而不是 Ser727 位點(diǎn)）磷酸化增加，從而促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷；PAI-039 有效抑制了 STAT3 Tyr705 位點(diǎn)磷酸化，并減輕了LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷；此外，AZD1480 能抑制STAT3 的Tyr705 和Ser727磷酸化，并減弱了LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷，表明STAT3 激活是PAI-1 招募中性粒細(xì)胞富集進(jìn)而促進(jìn)AEC Ⅱ細(xì)胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制STAT3的活性能改善PAI-1 募集中性粒細(xì)胞促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷。圖6 為PAI-1 通過(guò)調(diào)控中性粒細(xì)胞-IL6-STAT3 軸促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ損傷的模式圖。

圖6 PAI-1-中性粒細(xì)胞-IL6-STAT3 軸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ損傷作用模式

綜上所述，本研究表明，在LPS 刺激下，PAI-1 被激活并釋放到AEC Ⅱ外，促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集，后者釋放大量的炎癥細(xì)胞因子IL-6，增加STAT3 的Tyr705 位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷；而PAI-039 抑制PAI-1 激活后，中性粒細(xì)胞募集減少，IL-6/STAT3 信號(hào)通路被抑制，LPS 誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞損傷獲得緩解。因此，PAI-1 是參與LPS 誘導(dǎo)肺損傷的重要分子，目前研究雖然仍處于起步階段，但為ALI/ARDS 提供了新的視角和理論基礎(chǔ)，并可能為臨床提供以PAI-1 為靶點(diǎn)的臨床干預(yù)思路。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。