3 種飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型表型比較

孟慶楠，張曉芙，熊雪蓮

復旦大學附屬中山醫院內分泌科，上海 200032

隨著肥胖和2 型糖尿病人數的增加，非酒精 性 脂 肪 肝 病（non-alcoholic fatty live disease,NAFLD）已成為全球最常見的慢性肝病，全球患病率約為25%［1］。在我國，NAFLD 患病率已從2000 年的23.8%增長到2018 年的32.9%，成為我國發病率最高的肝臟疾病［2］。NAFLD 譜由非酒精 性 脂 肪 肝（non-alcoholic fatty liver, NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）、肝纖維化等構成。其中，NASH 為較嚴重階段，以小葉炎癥、肝細胞脂肪變性、肝纖維化和肝細胞死亡為病理特征［3］。NASH 在 NAFLD 人群中占比較高，且可能進展為肝硬化和肝細胞癌，且已成為肝移植和肝臟相關死亡的主要原因［4］，給全球帶來巨大的衛生經濟負擔。

因此，深入了解NASH 的機制、研發相應藥物是臨床迫切需求，然而目前尚無FDA 批準的專門用于治療NASH 的藥物。研發NASH 藥物的主要阻礙之一為缺少理想的動物模型。理想的動物模型應與人類疾病的生化、代謝、組織學、分子通路等多方面特征一致或接近。目前已經通過基因工程、飲食誘導、化學誘導等方法，開發了多種NASH 動物模型，然而大多數模型并不能完整復現人類NASH［5］。因此，在科學研究和藥物研發時，需要深入了解各模型的特點，選擇合適的動物模型或模型組合，從而提高從動物試驗到臨床應用的可轉化性。

本研究建立了高脂飲食（high-fat diet, HFD）、Amylin 飲食，以及高脂-蛋氨酸膽堿缺乏飲食（high-fat methionine- and choline-deficient, HFMCD）誘導的NASH 小鼠模型，并檢測生化、代謝等指標，評估肝臟組織學變化，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 實驗用動物均為SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，8～9 周齡，體質量為 22～25 g，購于上海實驗動物公司。小鼠飼料購于Research Diets 公司，分別為普通飼料(D11112201；65%碳水化合物，20%蛋白質，15%脂肪)，HFD 飼料（D12492；60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋 白 質 ），Amylin 飼 料（D09100301; 40% 脂肪，22%果糖，10%蔗糖，2%膽固醇），以及HFMCD 飼料（A06071301B; 60%脂肪，無蛋氨酸，無膽堿）。小鼠血清谷氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase, ALT）、血清天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase, AST），肝 臟 三 酰甘油 (triglycerides, TG)、肝臟羥脯氨酸檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。血糖檢測采用Roche 血糖儀及試紙。本研究通過復旦大學附屬中山醫院動物倫理審批（ZS334）。

1.2 動物飼養 小鼠飼養于復旦大學上海醫學院實驗動物中心，屏障環境為(22±2)℃，相對濕度保持在40%～60%，給予12 h 交替光照，小鼠自由進食、進水。根據飲食分為普通飲食（chow diet，CD）組、HFD 組、Amylin 組和HFMCD 組，每組10 只。其中，HFD、Amylin 飼料喂養時長為24 周，HFMCD 飼料喂養時長為10 周。喂養期間，通過在實驗開始、換籠期間和實驗結束時稱量食物質量來監測食物消耗。

1.3 血清指標檢測 喂養結束時，取小鼠眼眶靜脈血；血液靜置于無內毒素試管2 h，在4℃、1 000×g 條件下離心 10 min 后取上清液（血清）。血清ALT、AST，肝臟TG、肝臟羥脯氨酸檢測均按照試劑盒說明書進行。小鼠禁食10 h 后，尾尖采血，用血糖儀測定其空腹血糖值。胰島素耐量試驗（insulin tolerance test, ITT）：小鼠禁食 4 h 后所測血糖值記為0 min 血糖，隨后腹腔注射胰島素（0.75 U/kg），分別檢測注射胰島素后15、30、45、60、90、120 min 時間點的血糖并用 0 min 血糖值矯正，繪制曲線。

1.4 肝組織石蠟切片及病理檢查 取血后，用頸椎脫位法處死小鼠，剝離肝臟。肝臟稱質量后，取1 cm×1 cm×0.5 cm 大小肝組織，浸于 4%多聚甲醛固定24 h，隨后用濃度遞增乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，最后切片。肝指數=肝臟質量/小鼠體質量。

蘇木精-伊紅（H-E）染色：將石蠟切片梯度脫蠟后，用蘇木精染色1 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數秒，水洗，1%氨水返藍30 s，再次水洗，用伊紅染液染色2 min，洗滌；常規用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。天狼星紅染色：將石蠟切片梯度脫蠟后，用Weigert 鐵蘇木精染液染色10 min，水洗，天狼星紅染液滴染1 h，水洗；常規脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.5 統計學處理 用 GraphPad Prism 9.0.0 軟件作圖與進行統計學分析，數據以x±s 表示，組間比較采用t 檢驗，檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 小鼠體質量和肝臟重量 HFD 組、Amylin組小鼠體質量顯著高于CD 組（P＜0.000 1）；HFMCD 組體質量與CD 組差異無統計學意義。HFD 組、Amylin 組、HFMCD 小鼠肝臟質量均高于 CD 組（P＜0.01）。Amylin 組、HFMCD 組 小鼠肝指數高于CD 組（P＜0.01）；HFD 組小鼠肝指數與CD 組差異無統計學意義。Amylin 組肝臟質量、肝指數較CD 組的升高倍數明顯更大（表1）。

表1 各組小鼠的體質量、肝臟質量和肝指數比較

2.2 生化指標 飲食誘導組小鼠的血清ALT 水平均高于CD 組（P＜0.05），其中HFD 組升高程度較小；Amylin 組和HFMCD 組小鼠血清AST 高于CD 組（P＜0.01），HFD 組 與 CD 組 AST 差 異 無統計學意義。飲食誘導組肝臟TG 含量均高于CD組（P＜0.01），其中Amylin 組升高程度最大。Amylin 組與HFMCD 組肝臟羥脯氨酸水平高于CD組（P＜0.01），HFD 組和CD 組肝臟羥脯氨酸水平差異無統計學意義（表2）。

表2 各組小鼠血清ALT、AST，肝臟三酰甘油、羥脯氨酸和空腹血糖比較

2.3 空腹血糖和ITT HFD 組和Amylin 組小鼠空腹血糖水平升高，HFMCD 組小鼠空腹血糖水平降低（P＜0.01，表2）。ITT 試驗中，Amylin 組各時間點血糖水平高于CD 組（P＜0.001），且升高最明顯；HFMCD 組各時間點血糖水平與CD 組差異無統計學意義（圖1）。

圖1 各組小鼠的ITT 測試結果

2.4 肝臟組織學 H-E 染色（圖2A）顯示：CD組肝臟組織結構完整，肝小葉清晰；飲食誘導組均出現肝脂肪變性及肝小葉炎性浸潤，脂肪變性嚴重程度依次為Amylin 組、HFMCD 組、HFD 組。天狼星紅染色（圖2B）顯示：飲食誘導組均有膠原纖維形成，其中HFMCD 組、Amylin 組膠原纖維形成較多，說明肝纖維化嚴重。

圖2 各組小鼠肝臟切片的H-E 染色（A）及天狼星紅染色（B）

3 討 論

NASH 已成為全球性的健康問題，而動物模型無法很好模擬人類疾病阻礙了相關藥物的研發。因此，需要正確選擇或組合動物模型，從而更準確地預測藥物在人體內的反應［6］。將不同模型相結合以利用各自的優勢是NASH 研究的常用方法，例如db/db、ob/ob 基因突變小鼠常用于研究與早期NAFLD 相關的代謝綜合征，蛋氨酸膽堿缺乏（methionine- and choline-deficient, MCD）模型常用于研究短時間內NASH 肝臟的晚期纖維化［7］。本研究建立了3 種飲食誘導的NASH 小鼠模型，比較NASH 相關指標，旨在評估各模型的臨床可轉化性。

HFD 被廣泛用于誘導實驗動物發生NASH。HFD 模型與人類 NASH 多種表型相似，包括肥胖、胰島素抵抗、血脂異常等［8］。然而，該模型表型受動物品系、飲食中脂肪的含量、各類脂肪的組成以及誘導持續時間等影響［9］。而且，HFD誘導的肝損傷常不嚴重［10］。本研究顯示，與CD組相比，HFD 組體質量升高，并出現明顯的胰島素抵抗，但是肝細胞受損指標ALT、肝纖維化指標羥脯氨酸升高不明顯，肝組織染色也顯示小鼠NASH的特征性病理表現不如其他飲食誘導模型嚴重。

Amylin 飲食能可靠誘導類似人類疾病生化、代謝和組織學等特征的動物模型［11］。本研究中，Amylin 組小鼠體質量、肝臟質量、胰島素敏感性下降及肝臟病變程度均高于CD 組，NASH 表型與人類類似。因此，Amylin 飲食誘導的NASH 具有較高的臨床可轉化性。然而，近期FDA 禁止將反式脂肪作為食品添加劑。目前已研發出可替代Amylin 飲食的 Gubra Amylin NASH（GAN）飲食，GAN 與Amylin 飲食具有相同的能量比例和類似的誘導效果［12］。

HFMCD 是近期新建立的NASH 誘導飲食，為HFD 和 MCD 兩種飲食結構的結合［13］。MCD已被廣泛用于NASH 研究，能快速誘導多個嚴重的NASH 表型，但不能誘導胰島素抵抗［14］。既往研究［15］評估了HFMCD 的誘導效果，發現其能迅速誘導肝損傷、脂肪累積、炎癥反應和纖維化，不導致顯著的體質量改變，但使肝指數增加。然而，HFMCD 同樣不能導致胰島素抵抗［16］。本研究得出相似結果。

目前，國內外鮮見研究對上述3 種飲食模型進行比較。本研究結果說明，3 種飲食誘導的NASH小鼠模型各有優劣勢：HFD 能有效誘導肥胖、胰島素抵抗等NASH 患者常見的代謝紊亂，但難以導致嚴重的肝臟病變；Amylin 飲食不僅能引起顯著的肥胖和胰島素抵抗，其誘導的肝臟病變也較嚴重；HFMCD 相較于前2 種模型，能更迅速引起明顯的NASH 特征，但不能導致肥胖和胰島素抵抗。

綜上所述，本研究為NASH 機制研究和藥物研發中臨床前模型的選擇提供了一定參考。未來可通過分析各動物模型中人類NASH 中的關鍵信號通路（如炎癥信號、凋亡信號）的變化，并從轉錄組、代謝組學角度評價動物模型，以進一步改進動物模型，進而更好地服務于臨床。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。