石油污染土壤的堆肥修復及微生物群落結構分析

汪 洋，趙雪嬌，姚 健

(廣州南方學院，廣東 廣州 510970)

1 引言

石油污染土壤的堆肥修復技術具有成本低、效率高、無二次污染、堆肥產物可再生利用等特點，是石油污染生物修復的研究熱點。堆肥修復的實質是利用堆體中存在的眾多微生物，在發酵反應的過程中將大分子有機物降解為小分子，最后轉化為腐殖質肥料的過程。近年來，研究人員通過在自然堆肥中投加微生物復合菌群或生物表面活性劑達到強化堆肥的目的，其效果已得到驗證，相關報道較為豐富，但是對于不同堆肥方式中微生物菌群結構的變化、優勢菌群的組成規律以及強化堆肥的作用機制研究尚少，因此很難從根本上調控堆肥過程，從而提高堆肥效率。

本研究利用自然堆肥、復合菌群強化堆肥、表面活性劑強化堆肥3種堆肥方式處理石油污染土壤，利用16S rDNA的高通量測序技術研究了3種不同堆肥方式在高溫期、降溫期和腐熟期的主要微生物細菌的多樣性，分析優勢菌群的動態變化，探討了不同堆肥方式中各類微生物的組成規律。通過對堆肥各時期微生物豐富度的評價和分布特征的考察，結合3種堆肥方式的石油降解規律。深入探討強化堆肥機制，為進一步完善堆肥菌群構造，調試菌群效能，探索功能基團提供了有利依據，也為強化堆肥優化工藝參數提供科學依據。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

土壤樣品：大慶油田采油三廠油井附近(50～200 m)重度污染土，棋盤式五點采樣法取樣，等量混合均勻后1～2 cm網篩過篩備用(表1)。

堆肥樣品：分別取自然堆肥的堆1、表面活性劑強化堆肥的堆2、復合菌強化堆肥的堆3在高溫期(第6～7 d)、降溫期(第15～17 d)和腐熟期(第26～28 d)3個時期的堆肥樣品共9個和堆肥原樣N0進行高通量測序研究，五點取樣法，將樣品混合均勻后一分為二，一份-80 ℃保存，一份進行DNA的提取(表2)。

菌種：從自然堆肥高溫期篩選的耐高溫石油降解復合菌群wt-3(表3)。

表1 供試土壤理化性質

表2 高通量測序樣品

2.2 試驗方法

2.2.1 石油污染土壤的堆肥處理

將玉米秸稈撕碎備用，與搗碎的風干牛糞混合，加入石油污染土壤，調整堆體碳氮比為32∶1，總質量約為130 kg。試驗設置3個處理，堆體1為自然堆肥，堆體2是將堆肥樣與鼠李糖脂按照質量比為1000∶1的比例加入溶于水的鼠李糖脂粗品(湖州紫金生物科技有限公司)，充分混合后調節堆體含水率為 65%～70%。堆體3是將復合菌群按照1%的質量比噴灑在堆體上，混合后調節含水率。3個堆體均堆成直徑1.2 m高1 m的圓錐體。在堆體表面覆蓋塑料薄膜盡可能保持溫度和濕度，頂部插入3支溫度計，分別測量堆體上中下三層的溫度，每天早晚記錄溫度，每兩周翻堆一次，每周在堆體5個不同位置取堆肥樣，混合備用進行檢測。

表3 復合菌群wt-3組成

2.2.2 堆肥過程石油烴降解率的測定

3種堆肥方式每周收集的堆肥樣品進行總石油烴(TPH)的測定，采用超聲-索氏提取重量法[1]。

2.2.3 堆肥樣品DNA提取及PCR擴增

堆肥樣品預處理以清除雜質，利用MO BIO強力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoil DNA Isolation Kit)提取DNA，細菌16S r DNA 基因擴增正向引物為338F：5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'；反向引物806R：5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，反應體系為20 μL：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，運行27個循環反應程序包括95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃總延伸10 min。擴增序列長度為468bp，擴增片段混合通過Roche 454生命科學GS-FLX測序系統進行高通量測序分析。

2.2.4 堆肥樣品的高通量測序檢測

將測序產物的非特異性擴增片段去除，剪切去除產物中的homologous、ambiguous和長度過短的序列。利用Mothur 軟件以97%為劃定閾值對序列劃分操作分類單元OTU，運行軟件 mothur( http: / /www. Mother. org /) 中summary. single命令，計算常用的生物多樣性指數，如豐富度指數( Chao /ACE ) 、覆蓋率指數 ( Good's coverage ) 和多樣性指數 ( Shannon/Simpson) 。

3 結果與分析

3.1 堆肥過程石油烴降解率的測定

3種堆肥方式石油烴降解趨勢各有不同，在42 d堆肥結束時，自然堆肥的石油烴降解率達到69%、表面活性劑強化堆肥為88%，復合菌強化堆肥降解率為80%。兩種強化堆肥在1～10 d的高溫期和11～23 d的降溫期TPH降解率明顯高于自然堆肥，其中添加復合菌群的堆3在高溫期TPH降解顯著，添加表面活性劑的堆2降溫期TPH降解明顯，自然堆肥在24～42 d的腐熟期TPH降解明顯(圖1)。不同堆肥方式中TPH降解趨勢的不同分析是因為堆肥機制不用造成的，需借助高通量測序深入分析。

3.2 高通量測序數據分析

3.2.1 堆肥樣品群落多樣性和豐富度分析

10個樣品的coverage數值都在0.99左右，說明所測樣品中序列被測出的概率很高。OTU 的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度，Chao1和ACE指數分別表示達到飽和測序時所能獲得的最大物種數量，10個樣品的Chao值由高到低依次為：B3>C3>B2>N3>C2>N2>B1>C1>N1>N0，表明2種強化堆肥在降溫期和腐熟期微生物物種數較多，3個堆體均在高溫期所測的微生物物種數量最少。Shannon和Simpson指數用于表示微生物群落多樣性，結果與Chao值一致，兩種強化堆肥均在進入降溫期后微生物多樣性有了顯著提升，其中表面活性劑強化堆肥在降溫期和腐熟期Simpson指數分別為5.22和5.48，分析原因是生物表面活性劑調節了堆體的微環境從而促進了細菌的生長(表4)。

圖1 石油烴降解變化

表4 不同堆肥樣品多樣性和豐富度統計

3.2.2 堆肥樣品群落結構分析

3.2.2.1 不同堆肥樣品門水平微生物群落結構分析

對自然堆肥的N0、N1、N2、N3、表面活性劑強化堆肥的B1、B2、B3和復合菌群強化堆肥的C1、C2、C3共10個樣品在門水平的菌群類群進行分析。結果如圖2所示，堆肥樣品主要來自28個門，其中Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria、Gemmatimonadetes為優勢門。

變形菌門(Proteobacteria)是堆肥過程中的主要優勢菌群，在添加了表面活性劑的堆體B1、B2、B3中更為豐富，分別占比例29.2%、31.4%和23.3%，厚壁菌門(Firmicutes)為3個堆體高溫期和降溫期的共同優勢菌，這與Firmicutes可在高溫下(>55 ℃)存活，并能參與各種代謝活動有關。Fatima等[2]研究表明，石油烴的降解菌主要來白于變形菌門和厚壁菌門。擬桿菌門(Bacteroidetes)作為堆肥優勢菌群可能與Bacteroidetes中的多種微生物可降解淀粉、纖維素和幾丁質等大分子有機物有關[3]，堆肥處理中所添加的秸稈是促進Bacteroidetes 成為優勢類群的原因之一。綠彎菌門(Chloroflexi)是牛糞堆肥過程中比較常見的菌群，在復合菌強化堆肥的 C1、C2、C3中更具優勢，分別占27.5%、15.6%和22.2%，研究表明，Chloroflexi同樣具有降解大分子有機物的能力，添加復合菌劑的堆體因為Chloroflexi的優勢存在而加快了腐熟過程[4]，梁建芳[5]對新疆克拉瑪依油田石油污染土壤的16S rRNA克隆文庫研究發現，含油土壤中的細菌大多屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和浮霉狀菌門(Planctomycetes)。這與本研究結論吻合。

圖2 不同堆肥樣品在門水平的細菌群落構成

3.2.2.2 不同堆肥樣品綱水平微生物群落結構分析

3種不同堆肥方式的10個堆肥樣品16S rDNA序列測序結果在綱的水平進一步分析，所得序列主要屬于21個綱，見圖3。其中10個主要優勢綱是Bacilli、Gammaproteobacteria、 Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Anaerolineae、Cytophagia、Flavobacteriia、Chloroflexia和Clostridia。

圖3 不同堆肥樣品在綱水平的細菌群落構成

不同堆肥方式的優勢綱各有不同，自然堆肥中Actinobacteria為典型的優勢綱，在高溫期(24.8%)、降溫期(14.5%)和腐熟期(19.2%)都占較大比例，其次是Bacilli，占比分別為16.7%、25.3%和5.7%。表面活性劑強化堆肥中Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Flavobacteriia為優勢綱，Gammaproteobacteria在高溫期、降溫期和腐熟期所占比例分別為13.2%、13.6%和10.1%；Alphaproteobacteria所占比例分別為12.7%、12.5%和9.7%；Flavobacteriia為8.6%、9.8%和7.4%。復合菌群強化堆肥中Bacilli、Gammaproteobacteria和Anaerolineae為優勢綱，其中Bacilli在高溫期、降溫期和腐熟期所占比例分別為20%、22.2%和5.7%；Gammaproteobacteria分別占比例為14.6%、15%和9.6%，可見不同的堆肥方式可引起菌群結構的大幅變化。

芽孢桿菌綱(Bacilli)屬于厚壁菌門(Firmicutes)，在3種堆肥方式中均占較大比例，有大量文獻表明芽孢桿菌綱可降解石油烴物質，同時可分解纖維素、木質素等有機物，其耐高溫的特性使其在堆肥的高溫期和降溫期有較高豐度。

將3種堆肥方式中的石油降解速率與優勢綱進行相關性分析，結果見表5。

表5 石油降解速率與堆肥細菌優勢綱的相關性

自然堆肥中，TPH降解速率與Actinobacteria(r=0.995)成顯著正相關；表面活性劑強化堆肥中，TPH降解速率與Gammaproteobacteria(r=0.985)和Flavobacteriia(r=0.995)呈顯著正相關；復合菌群強化堆肥中，降解速率與Gammaproteobacteria(r=0.999)呈顯著正相關，與Bacilli(r=0.987)相關性較大，由此可知。不同堆肥方式優勢綱有所不同，說明發揮主要作用的菌群互不一樣，有待于進一步研究。

3.2.2.3 不同堆肥樣品屬水平微生物群落結構分析

將3種不同堆肥方式的10個堆肥樣品在分類學屬的水平上進行群落構成分析，取相對豐度前40的屬進行繪圖，見圖4。

可見共有的優勢屬為Sporosarcinasp.、Pseudomonassp.、Flavobacteriumsp.、Psychrobacillussp.、Phyllobacteriaceae_unclassifiedsp.、Saccharibacteria_noranksp.、Bacillussp.、Gordoniasp.。另有Anaerolineaceae_unculturedsp.、Candidatus_Chloroplocasp. 和Chryseolineasp.在N0和N1期含量極少，卻是其他9個樣品中的優勢菌群，分析原因可能是未發酵的堆肥原樣菌落結構與堆肥期的差距較大，而N1樣品因為來自剛剛翻堆后的高溫期，因此細菌群落結構短期內有較大變化。

圖4 不同堆肥樣品在屬水平的細菌群落構成

豐度圖中與已報道的石油烴降解有關的菌有黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonassp. )、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)、諾卡氏菌屬(Nocardiasp.)、德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)、戈登氏菌屬(Gordoniasp.)、分支桿菌屬(Mycobacteriumsp.)、Pusillimonassp.、Steroidobactersp.和Lysinibacillussp.。在優勢菌菌屬中所占比例為30%，證明堆肥誘發了石油土中相關降解菌的發酵增殖。

由圖4還可看出:不同堆肥方式石油烴降解優勢菌各不不同，自然堆肥中的最豐富的烴降解菌屬為Rhodococcussp.(2.3%～7.4%)、Bacillussp.(1.4%～4.8%)和Steroidobactersp.(1.2%～3.5%)。表面活性劑強化堆肥中豐度最高的降解菌屬是Flavobacteriumsp.(9.9%～13%)、Pseudomonassp.(1.3%～7.5%)、Gordoniasp. (2.2%～3.2%)和Pusillimonassp.(1.5%～3.5%)，復合菌群強化堆肥中豐度最高的降解菌屬是Pseudomonas(2.5%～13%)、Bacillussp.(1.6%～5.5%)、Lysinibacillussp.(0.9%～10.3%)和Mycobacteriumsp. (1%～3.3%)。初步認為，添加了表面活性劑的堆體中石油烴降解菌群更加豐富，是因為鼠李糖脂激活了多種微生物包括烴降解菌的增殖表達，從而使堆體的有機污染物降解速率加快，縮短了堆肥時間，提高了堆肥效率。

屬水平的石油降解率相關性分析見表6。自然堆肥中，TPH降解速率與Rhodococcussp.(r=0.997)和Steroidobactersp.(r=1.000)呈顯著正相關。其中Steroidobactersp.屬于γ-Proteobacteria綱，Rhodococcus sp.屬于Actinobacteria綱，結論與綱的相關性較為一致。

表6 石油降解速率與堆肥細菌優勢屬的相關性

表面活性劑強化堆肥中，TPH降解速率與Pseudomonassp.(r=0.916)和Flavobacteriumsp.(r=0.991)顯著正相關，其中Pseudomonassp.屬于γ-Proteobacteria綱，Flavobacteriumsp.屬于Flavobacteriia綱，結論與綱的相關性一致。在復合菌群強化堆肥中，TPH降解速率與烴降解菌Pseudomonassp.(r=0.987)顯著正相關，與Bacillussp.(r=0.913)相關性大，結論與綱相關性結論基本相符。

4 討論

(1)在石油污染土壤的堆肥修復研究中，自然堆肥和兩種強化堆肥方式都對土壤中的石油烴降解有明顯促進作用，但表面活性劑強化堆肥效果最為明顯，分析原因是不同堆肥體系中微生物菌群結構組成不同所致，需進一步結合堆肥體系的微生物動態群落結構分析。

(2)在對微生物群落綱水平的結構分析時發現，Gammaproteobacteria(γ-Proteobacteria)和Alphaproteobacteria(α-Proteobacteria)是降解石油污染物的主要菌群。這與王新新[6]在對含油污泥堆肥處理進行16S rDNA克隆文庫研究時的發現一致，他認為γ-Proteobacteria的數量與石油烴含量呈正相關。同時有研究表明，α-Proteobacteria的Alcanivorax sp.等在受油污染的土壤和海洋環境中普遍存在，但本研究中α-Proteobacteria的相應烴降解菌屬并未作為優勢菌出現[7]。自然堆肥中，放線菌綱(Actinobacteria)作為優勢菌群，其豐度結果與堆肥樣品的放線菌菌落生長狀況基本一致，研究表明，Actinobacteria在石油烴降解、石油脫蠟、甾體轉化和污水處理等方面有廣泛用途，并在氮素循環中發揮一定作用[8]。黃桿菌綱(Flavobacteriia)是表面活性劑強化堆肥中特有的優勢菌綱，其中眾多菌屬都具有降解PHAs和BTEX(苯、乙苯、甲苯、二甲苯)的功能[9]。

(3)根據圖1可知，不同堆肥方式TPH降解趨勢各不相同，自然堆肥的堆體在腐熟階段TPH降解效果最明顯(30.6%)，表面活性劑堆體TPH在降溫期降解效果明顯(33.2%)，而而復合菌群堆體則在高溫階段降解最顯著(34%)。結合菌群結構分析表明，降解規律的不同是由不同堆體菌群變化差異導致的，自然堆肥過程中，經歷高溫階段的大分子堆肥物料被分解為小分子，堆體中微生物分布更為均勻，大量嗜溫菌在進入腐熟期后達到峰值，其中Rhodococcus、Steroidobacter、Mycobacterium和Pseudomonas均在腐熟期含量達到最高值，Rhodococcus和Steroidobacter與石油烴降解顯著正相關，因此堆體中的TPH降解在腐熟階段效果最顯著。在表面活性劑強化堆肥中，鼠李糖脂改善了堆體介質的微環境，經歷了高溫期后，介質中有機物在表面活性劑作用下完成了增溶和分散作用，促使堆體微生物的分布狀況都發生了巨大變化，降溫期烴降解菌的Pseudomonas、Flavobacterium、Pusillimonas和Mycobacterium的激活顯著，在堆肥體系中維持著較高的菌群濃度，Pseudomonas、Flavobacterium與石油烴降解顯著正相關，因此降溫期階段TPH降解速率達到高峰。在復合菌強化堆肥中，堆肥初期投加的wt-3中的Pseudomonas sp.、Bacillus sp.和Lysinibacillus sp.在堆肥過程中作為優勢菌存在，且其中的Pseudomonassp.和Bacillus sp.與TPH降解率相關性較大，說明wt-3土著菌群能快速適應堆體環境，作為穩定的石油烴降解菌系與堆體中的眾多微生物發生協同作用，堆體因為wt-3的加入而使溫度迅速上升并表現出高溫期的烴降解效果顯著，說明wt-3的部分菌在強化堆肥中發揮了主要作用。

5 結論

(1)自然堆肥、表面活性劑強化堆肥和復合群強化堆肥3種堆肥方式均可有效降解堆體中的含油污染物，但兩種強化堆肥方式降解效果更為顯著，其中添加了鼠李糖脂的堆體在42 d堆肥結束后，TPH降解率達88%。不同堆肥方式TPH最高降解速率出現的時間不同，自然堆肥在腐熟期TPH降解顯著，表面活性劑強化堆肥在降溫期TPH降解明顯，而復合群強化堆肥TPH降解高效期出現在高溫期，這是由不同堆肥方式中菌群結構和組成的改變而決定的。

(2)高通量測定結果表明，兩種強化堆肥在各時期的菌群豐富度和多樣性均高于自然堆肥，在表面活性劑強化堆肥中，鼠李糖脂通過物化效應和微生物效應改善了堆肥介質的微環境，激發了眾多微生物的增殖，推動了有機物的降解。復合群強化堆肥中，wt-3因與堆體中微生物的協同作用促進了菌群的多樣化，從而使菌群結構發生改變。

(3)通過綱水平和屬水平的TPH降解相關性分析表明，不同堆肥方式中發揮主要作用的石油烴降解菌各不相同，自然堆肥中Rhodococcussp.作為重要的烴降解功能微生物發揮主要作用；表面活化劑強化堆肥中Pseudomonassp.和Flavobacteriumsp.是重要的烴降解功能微生物；復合菌群強化堆肥中Pseudomonassp.和Bacillussp.作為主要的功能微生物在堆肥過程中發揮了主要作用。但深入的堆肥降解機制還要結合功能基因克隆文庫協調分析。