有色米乳酸飲料發酵工藝優化及抗氧化和降血糖活性研究

劉 婷 李嘉妮 沈俊利 陸 俊 楊雯驛

(1. 中國檢驗認證集團湖南有限公司，湖南 長沙 410021； 2. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

乳酸飲料由于口味酸甜爽口，富含活性益生菌和乳酸類代謝成分，在飲料市場中占比越來越高。有色米乳酸飲料是以黑米和紫米為主要原料，利用乳酸菌發酵形成的一種功能性乳酸飲料。黑米和紫米富含包括類黃酮(特別是花青素和原花青素)、酚酸類化合物(如咖啡酸、阿魏酸等)、植物甾醇(如β-谷甾醇、豆甾醇和辣椒醇)等活性成分[1-3]，具有抗氧化、降膽固醇、降血糖等作用。其中黑米含有的活性成分相對其他有色米較多，使之有較強的清除活性氧自由基、羥自由基和DPPH自由基的抗氧化作用[4-5]。研究[6-10]表明，利用一些益生菌發酵果蔬或糧谷類食品，能有效提升產品口感，增強特殊風味，同時，還能提高產品的營養價值。如利用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌接種濃縮黑米漿發酵，可得到口感清爽，紫紅色、有淡淡米香味和發酵風味的復合益生菌黑米飲料[7]；以黑米和紅棗為原料，可制得比紅棗乳酸飲料有更好色澤、風味、滋味和適口性的黑米紅棗乳酸飲料[8]；以黑米和脫脂乳粉為主要原料可制得口感、色澤和質地良好的乳酸飲料[9]；以及以嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌混合發酵劑發酵燕麥、黑米、糙米，可得到狀態均勻、谷香濃郁、酸甜可口的發酵谷物飲料[10]。而關于以不同比例復配的有色米為原料，利用復合益生菌發酵生產乳酸飲料，并分析其抗氧化活性和降糖活性的研究尚未見報道。

研究擬以黑米、紅米和紫米等有色米為研究對象，以益生菌果蔬酵素發酵粉為發酵菌種，通過單因素和正交試驗研究有色米乳酸飲料的發酵工藝條件，并對其抗氧化活性和降血糖活性進行評價，以期為黑米、紫米等有色米的加工利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

黑米、紫米、紅米：陜西洋縣；

發酵粉：川秀益生菌果蔬酵素發酵粉，北京川秀科技有限公司；

熱穩定性α-淀粉酶:酶活4萬 U/g，上海源葉生物科技有限公司；

糖化酶:酶活10萬 U/mL，上海源葉生物科技有限公司；

磁力攪拌水浴鍋:HSJ-3A型，常州澳華儀器有限公司；

回旋式氣浴振蕩器:SHZ-82型，長葛式明途機械設備有限公司；

模式高速分散均質機:FA25型，上海弗魯克流體機械制造有限公司；

酶標儀:SpectraMax i3X型，美國Molecular Devices公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 有色米乳酸飲料制備工藝 參照文獻[10-11]修改如下：將3種有色米粉碎制粉過60目篩后按所需比例稱取混合后，加純水浸泡，放入磁力攪拌水浴鍋中進行加熱攪拌糊化，92.5 ℃恒溫30 min，冷卻至70 ℃，按8 U/g有色米加入熱穩定性α-淀粉酶，放入水浴鍋進行磁力攪拌加熱，待升溫至90 ℃后保溫10 min，冷卻至62 ℃，再按100 U/g有色米加入糖化酶，在62 ℃的磁力水浴鍋中不斷攪拌5 h，即得糖化醪。然后用均質機均質(500 W，10 000 r/min) 5～10 min，將糖化醪細化后，放入升溫至100 ℃的沸水中，持續5 min使酶滅活。冷卻后按需接種乳酸菌，放入恒溫箱(37 ℃)進行培養。

1.2.2 總酚含量測定 參照文獻[12]。

1.2.3 抗氧化活性測定

(1) 鐵離子還原能力：參照文獻[13]。

(2) ABTS自由基清除能力：參照文獻[12]。

1.2.4α-葡萄糖苷酶抑制率測定 參照文獻[14]。

1.2.5 感官評價 參照文獻[11]并適當修改，見表1。

表1 感官評價表Table 1 Sensory evaluation table

1.2.6 單因素試驗

(1) 有色米比例構成對有色米乳酸飲料品質的影響：固定乳酸菌發酵粉添加量為4%，料液比為1∶6 (g/mL)，發酵時間為44 h，考察紅米和黑米質量比(m紅米∶m黑米分別為1∶1，1∶3，1∶5)，以及紫米和黑米質量比(m紫米∶m黑米分別為1∶1，1∶3，1∶5)對有色米乳酸飲料品質的影響。

(2) 乳酸菌發酵粉添加量對有色米乳酸飲料品質的影響：固定紫米和黑米質量比(m紫米∶m黑米)為1∶5，料液比為1∶6 (g/mL)，發酵時間為44 h，考察乳酸菌發酵粉添加量(3%，4%，5%， 6%)對有色米乳酸飲料品質的影響。

(3) 發酵時間對有色米乳酸飲料品質的影響：固定紫米和黑米質量比(m紫米∶m黑米)為1∶5，乳酸菌發酵粉添加量為4%，料液比為1∶6 (g/mL)，考察發酵時間(24，28，32，36，40，44 h)對有色米乳酸飲料品質的影響。

(4) 料液比對有色米乳酸飲料品質的影響：固定紫米和黑米質量比(m紫米∶m黑米)為1∶5，乳酸菌發酵粉添加量為4%，發酵時間為44 h，考察料液比[1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12 (g/mL)]對有色米乳酸飲料品質的影響。

1.2.7 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選取紫米和黑米質量比、乳酸菌發酵粉添加量、發酵時間和料液比4個因素，考察各因素對有色米乳酸發酵飲料感官評價及抗氧化活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響。

1.2.8 數據分析 所有試驗平行3次，結果以平均值±標準偏差表示。使用SPSS 20.0軟件進行統計及分析，使用Spearman相關系數進行相關性檢測，P<0.05表示有顯著性差異；P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 有色米比例構成對有色米乳酸飲料品質的影響

由表2可知，紅米與黑米配方組得到的有色米乳酸飲料感官評分整體低于紫米與黑米配方組，紫米和黑米復配后有色米乳酸飲料感官評分隨黑米比重的增加逐漸升高，且以m紫米∶m黑米為1∶5的最佳。同理，當m紫米∶m黑米為1∶5時，有色米乳酸飲料的多酚含量最高，鐵離子還原能力最高為(24.52±1.30) mmol Fe2+/g·DW，ABTS自由基清除能力達最大為(77.08±13.18) mmol TE/g·DW。當m紅米∶m黑米為1∶1時，有色米乳酸飲料對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，稍高于m紫米∶m黑米為1∶5的，可能與黑米的總酚含量遠大于紫米和紅米有關[15]，尤其是與黑米中含有豐富的矢車菊-3-O-葡萄糖苷等花青素有較大關系。同時，紫米也具有良好的抗氧化性，在消化過程中釋放出的總酚量和總抗氧化性優于紅米[16]，因此，紫米和黑米發酵的乳酸飲料整體品質要優于紅米和黑米發酵的。而黑米比重越大，總酚含量也隨之增加，抗氧化活性越強，可能是有色稻的花青素和抗氧化能力與種皮顏色深淺呈正相關[3]。同時，乳酸發酵過程中產生的有機酸如乳酸、丙酸、醇醛等物質的香味交融滲透，產生了較好的香味[17]，使整體感官變佳。

表2 有色米比例構成對有色米乳酸飲料品質的影響Table 2 The effects of mass ratio of purple rice to black rice on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.1.2 乳酸菌發酵粉添加量對有色米乳酸飲料品質的影響 由表3可知，當乳酸菌發酵粉添加量為4%時，有色米乳酸飲料的感官評分最高，可能是在一定添加量范圍內，乳酸菌發酵粉添加量的增加使飲料中乳酸、乙酸、甲酸等物質增加[18]，產生特有的乳酸發酵風味，超過一定范圍后，乳酸菌代謝的酸性物質過量，會使有色米乳酸飲料酸味過重，風味口感較差。當乳酸菌發酵粉添加量為3%時，總酚含量最多，且隨著乳酸菌發酵粉添加量的增加，樣品中總酚含量呈下降趨勢，當乳酸菌發酵粉添加量為6%時，有色米乳酸飲料的總酚含量小幅度增加，可能是由于隨著復合乳酸菌添加量的增加，發酵反應過程中產生了越來越多的酸性代謝物、二氧化碳和細菌素等物質，對多酚有一定抑制或失活作用[19]。研究[20]表明，黑米中含有原兒茶酸、兒茶素、對羥基苯甲酸、香草酸等游離和結合酚類，當乳酸菌發酵粉添加量為6%時總酚含量有小幅度的上升，可能是因為釋放的結合多酚含量多于損耗的。有色米乳酸飲料的鐵離子還原能力和ABTS自由基清除能力均以乳酸菌發酵粉添加量為3%的最高，而后呈波動趨勢，其中ABTS自由基清除能力的變化趨勢與總酚的一致，均在乳酸菌發酵粉添加量為5%時達最低值，在6%時輕微上升，可能是由于較低乳酸菌發酵粉添加量下，游離抗氧化活性物質的損失量較低，而乳酸菌發酵粉添加量較高時產生的一些酸性物質會導致抗氧化成分的損失增加。有色米乳酸飲料對α-葡萄糖苷酶抑制率隨乳酸菌發酵粉添加量的增加而升高，且在乳酸菌發酵粉添加量為5%～6%時增幅明顯變大，可能是由于乳酸菌利用碳源進行同型發酵和異型發酵，產生大量的乳酸、乙酸等代謝產物，從而對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用[18]。

表3 乳酸菌發酵粉添加量對有色米乳酸飲料品質的影響Table 3 The effects of the addition amount of Lactobacillus on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.1.3 發酵時間對有色米乳酸飲料品質的影響 由表4可知，隨著發酵時間的延長，有色米乳酸飲料感官評分呈逐漸上升趨勢，以發酵44 h的最高，可能是由于乳酸菌得到了充分的生長繁殖，產生了較多的有機酸、酮、醛、酯等風味物質[21]，發酵時間越長，風味物質濃度越高，因此感官評分上升。隨著發酵時間的延長，總酚含量在36 h時達到峰值，隨后降低，可能是由于發酵前36 h，乳酸菌處于遲緩期和對數期前期，黑米和紫米中結合多酚的釋放也較為緩慢；進入對數生長后期和穩定期前期后，對樣品的利用率增大，結合多酚得到大量釋放；之后進入穩定期后期甚至衰亡期，乳酸菌生產代謝物對多酚的損耗導致總酚含量下降。發酵時間對有色米乳酸飲料的FRAP值和ABTS自由基清除能力的影響趨勢與總酚的類似，均隨發酵時間的延長先上升，且分別在32，36 h時達到峰值，而后下降。可能是以多酚類為代表的大部分抗氧化性活性物質，前期只有一定量處于游離態，隨著乳酸菌對樣品的利用，結合態抗氧化活性物質得到釋放，當中期乳酸菌含量達到一定程度時，對結合態抗氧化活性物的釋放能力大大增強，樣液中的抗氧化活性物質含量增大；隨著乳酸菌代謝產物的增多和結合態抗氧化活性物質的釋放程度減少，發酵時間過長也會引起花青素發生酶促和非酶促氧化[22]，導致樣液內的抗氧化活性物質降低，因此抗氧化活性呈下降趨勢。發酵0～32 h，隨著發酵時間的增加，有色米乳酸飲料對α-葡萄糖苷酶的抑酶能力先緩慢增加后驟然降低再上升，可能是在發酵前期，隨著乳酸菌的生長繁殖，產生的具有抑酶作用的代謝產物累加，抑酶率上升，而發酵后期因乳酸菌的大量繁殖，各種代謝產物增加，產生一定的拮抗作用使得抑酶率下降，而后乳酸菌的代謝產物濃度上升，抑酶率再次上升。

表4 發酵時間對有色米乳酸飲料品質的影響Table 4 The effects of fermentation time on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.1.4 料液比對有色米乳酸飲料品質的影響 由表5可知，當料液比為1∶4 (g/mL)時，有色米乳酸飲料的感官評分最好，隨著料液的增加，感官評分越低，可能是由于水量的增加，造成了風味物質的濃度變低，口感相對較寡淡，乳酸發酵風味相對較差。總酚含量隨料液比的增大呈先上升后下降的趨勢，當料液比為1∶8 (g/mL)時，總酚含量達最大，可能是由于該比例下促進了乳酸菌和樣品的充分接觸和反應，有利于乳酸菌對樣品的利用和結合多酚的釋放，多酚濃度增大；水量繼續增加則不利于發酵的有效進行，因此多酚難以有效釋放，總酚含量有所降低。有色米乳酸飲料FRAP值隨料液比的增大先上升后下降，可能是料液比在一定范圍內時，水量的增多可以促進乳酸菌和樣品的充分接觸和反應，有利于乳酸菌對樣品的利用和結合抗氧化性活性物質的釋放，但同時酸性物質含量相對增加，而在酸性條件下對FRAP的測定產生了一定影響，FRAP值呈下降趨勢。ABTS自由基清除能力受酸性條件的影響較小，料液比越大，可溶性抗氧化成分相對增加，在一定范圍內促進了ABTS自由基清除能力的提升。隨著料液比的增加，有色米乳酸飲料對α-葡萄糖苷酶的抑制率明顯下降，其最佳料液比為1∶4 (g/mL)，可能是由于抑制葡萄糖苷酶的活性物質隨發酵體積量的增多，單位濃度內的活性物質濃度降低，抑酶率下降。

表5 料液比對有色米乳酸飲料品質的影響Figure 5 The effects of the ratio of material to liquid on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取發酵時間、乳酸菌發酵粉添加量、有色米比例構成和料液比進行四因素三水平正交試驗，試驗因素水平見表6，試驗設計及結果見表7。

表6 試驗因素與水平設計表Table 6 Test factors and level design

由表7可知，以感官評分作為主要指標時，最佳工藝配方為A3B3C2D2，各因素對感官評分的影響程度從高到低為乳酸菌發酵粉添加量(B)>發酵時間(A)>料液比(D)>有色米比例構成(C)。以總酚含量作為主要指標時，最佳工藝配方為A2B3C1D2，各因素對總酚含量的影響程度從高到低為料液比(D)>乳酸菌發酵粉添加量(B)>發酵時間(A)>有色米比例構成(C)。以鐵離子還原能力作為主要指標時，最佳工藝配方為A3B3C2D3，各因素對鐵離子還原能力的影響程度從高到低為發酵時間(A)>料液比(D)>有色米比例構成(C)>乳酸菌發酵粉添加量(B)。以ABTS 自由基清除能力為主要指標時，最佳工藝配方為A3B1C2D3，各因素對鐵離子還原能力的影響程度從高到低為料液比(D)>發酵時間(A)>有色米比例構成(C)>乳酸菌發酵粉添加量(B)。以α-葡萄糖苷酶抑制率為主要指標時，最佳工藝配方為A1B3C1D1，各因素對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響由大到小為發酵時間(A)>料液比(D)>有色米比例構成(C)>乳酸菌發酵粉添加量(B)。

表7 L9(34)正交試驗設計及結果Table 7 L9(34) orthogonal test results

根據各指標所得的最佳工藝配方為A3B3C2D2、A2B3C1D2、A3B3C2D3、A3B1C2D3、A1B3C1D1，其中以總酚含量為主要參考依據所得的最佳配方A2B3C1D2為正交試驗第6組，其余所得的最佳配方均不是正交試驗內的配方，且有一定差距，需進行進一步試驗和指標測定。

由表8可知，A2B3C1D2的抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制能力均為最佳，感官評分為83.60±2.51，略低于A3B3C2D2的，且又具有良好的抗氧化能力，總酚含量為(4 208.78±281.26) μg GAE/g·DW，ABTS自由基清除能力為(145.02±7.88) mmol TE/g·DW，總酚含量和ABTS自由基清除能力顯著高于采用單一菌種發酵單一或復合有色米的總酚含量[22]。鐵離子還原能力(FRAP)為 (33.41±1.70) mmol Fe2+/g·DW，α-葡萄糖苷酶抑制活性為(13.94±0.01)%，因此，選擇最佳配方為A2B3C1D2，即紫米和黑米質量比為1∶5，料液比為1∶8 (g/mL)，乳酸菌發酵粉添加量為5%，發酵時間為40 h，該條件下有色米乳酸飲料產品色澤均一，呈紫紅色，有典型的發酵香味，口感柔和，酸甜味適中，無沉淀物。

表8 驗證組的感官評價，總酚含量，鐵離子還原能力，ABTS自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制率Table 8 Sensory evaluation value,total phenolics content, FRAP, ABTS free radical scavenging ability, and the inhibition rate of α-glucosidase of the validation group

3 結論

試驗表明，有色米乳酸飲料的最佳發酵工藝條件為紫米和黑米質量比為1∶5，料液比為1∶8 (g/mL)，乳酸菌發酵粉添加量為5%，發酵時間為40 h，該條件下有色米乳酸飲料感官評分近84，產品色澤均一，呈紫紅色，有典型的發酵香味，口感柔和，酸甜味適中，無沉淀物。后續可借助液質等手段解析有色米乳酸飲料發酵過程中酚酸及花色苷等多酚類活性成分的組成與含量變化，以及測定出乳酸飲料中各菌種的含量水平，進一步研究其體內的作用效果和機理。