芋ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）基因家族的克隆、生物信息學及表達分析

何芳練，劉莉莉，蔣慧萍，邱祖楊，黃詩宇，董偉清*

芋ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）基因家族的克隆、生物信息學及表達分析

何芳練1，劉莉莉2，蔣慧萍1，邱祖楊2，黃詩宇1，董偉清1*

1. 廣西壯族自治區農業科學院生物技術研究所，廣西南寧 530007；2. 荔浦市農業農村局，廣西荔浦 546600

芋（）為天南星科芋屬成員，在世界范圍內廣泛種植，其球莖主要貯藏物質為淀粉。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成的第一個關鍵酶和限速酶，在植物淀粉合成中發揮關鍵作用，但目前關于芋AGPase基因家族的分子結構特征和表達模式還不清楚。本研究以芋新品種‘荔浦芋1號’為試材，從全長轉錄組注釋信息中篩選到6個AGPase基因家族成員，利用RT-PCR技術克隆了6個基因的編碼區，利用生物信息學對其理化性質、進化關系和保守motif進行分析；同時利用轉錄組學和熒光定量RT-PCR技術對6個基因在不同組織和球莖不同發育階段的表達模式進行分析。結果表明：克隆獲得6個芋AGPase基因編碼區的cDNA序列，序列長度為1398～2028 bp，編碼的蛋白大小為350～543 aa，其中4個基因（～）編碼AGPase的大亞基，2個基因（，）編碼AGPase的小亞基。系統進化分析顯示，所有的AGPase分成了大亞基和小亞基2個群組，4個大亞基分在了大亞基組，2個小亞基分在了小亞基組。CeAGP家族蛋白分子質量范圍為38 753.22～59 743.05 kDa，等電點范圍為5.64～8.82，亞細胞定位為葉綠體、淀粉體和細胞質等。蛋白的保守motif分析發現，CeAGP家族蛋白共預測到11個保守motif，6個motif功能注釋為NTP_transferase，除CeAGPS2外，另外5個CeAGP蛋白均包含11個motif。在不同組織中，6個基因均能在所有組織中表達，其中和基因在葉片和葉柄中高表達，和基因在球莖中高表達，6個基因在根的表達量均較低。在球莖不同發育階段中，和高表達且均表現先升高后降低的趨勢，2個基因分別在4月齡和5月齡階段的表達量最高。該研究結果為后續闡明芋淀粉合成的分子機制提供依據。

芋；AGPase；基因克隆；表達分析

芋（Schott），別名芋頭、芋艿，為天南星科芋屬成員，在世界范圍內廣泛種植[1]。芋是一種古老的作物，其種植歷史可以追溯到28 000年前[2]。球莖是芋的主要食用部位，富含碳水化合物、蛋白質、纖維和礦物質等[3]，其中淀粉是其主要貯藏物質，占干物質含量的73%～80%[4]。

在植物中，淀粉的生物合成受一系列酶的調控，如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）、淀粉合成酶（starch synthase，SS）、淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）和脫分支酶（debranching enzyme，DBE）等[5-7]，其中AGPase（EC 2.7.7.27）是淀粉合成的第一個關鍵酶和限速酶，影響植物淀粉的合成速率[8]。AGPase將葡萄糖-1-磷酸（Glc- 1-P）和ATP催化形成ADP-葡萄糖（ADP-glucose）和無機焦磷酸（PPi），其中ADP-葡萄糖作為淀粉合成的起始底物[9]。在高等植物中，AGPaes是由2個大亞基和2個小亞基組成的異源四聚體[10]。在大亞基和小亞基的功能方面已經開展了大量的研究，基本明確小亞基具有催化和調節功能，而大亞基主要負責AGPase的構像調節[10-11]。

隨著測序技術和生物信息學的快速發展，許多植物的AGPase基因家族已經陸續被克隆和鑒定，不同植物的AGPase基因個數存在差異，如番茄、獼猴桃和西谷椰子有4個AGPase基因[12-14]；馬鈴薯、擬南芥、玉米和甘薯有6個AGPase基因[11, 15-17]；水稻和木薯有7個AGPase基因[9, 18-19]；香蕉有8個AGPase基因[20]。

目前，關于芋AGPase基因的研究報道較少，LIU等[21]對芋葉片進行轉錄組測序，篩選到26個與淀粉合成相關的候選基因，其中有1個AGPase基因；DONG等[22]對芋球莖不同發育階段的比較轉錄組分析，富集到與淀粉和蔗糖代謝相關的139個差異轉錄本和24個酶，其中富集到AGPase的轉錄本5條；王立等[5]克隆了芋AGPase小亞基基因（），該基因具有NTP_transf_3和PbH1結構域，表達模式與球莖淀粉含量的積累呈顯著正相關。本課題組在前期研究中，使用PacBio平臺對自主選育的芋新品種‘荔浦芋1號’3月齡植株的葉片、葉柄、球莖和根進行了混合樣全長轉錄組測序，共獲得高質量轉錄本序列38 043條，將獲得的序列與芋參考基因組[（Niue2），https://db.cngb.org/search/ project/ PRJNA328799/] 進行比對和功能注釋，有6個基因注釋為AGPase基因。根據全長轉錄組注釋信息，設計特異性克隆引物，克隆獲得6個芋AGPase基因的cDNA序列，通過生物信息學對其編碼蛋白的分子結構特性和系統進化進行分析；同時對6個AGPase基因在不同組織和球莖不同發育階段的表達模式進行分析，為進一步闡明芋淀粉合成的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為本課題組選育的芋新品種‘荔浦芋1號’，該品種為魁芋類型（檳榔芋），主要食用母芋，具有粉、香、糯等特點。2020年3月上旬種植于廣西農業科學院武鳴里建科學研究基地，田間管理和農事操作參考本課題組總結的檳榔芋輕簡化栽培技術。根據芋球莖發育時期，每月取樣一次，即連續取發育1、2、3、4、5、6、7、8月齡的球莖樣品，球莖在取樣時取中上部。不同組織的樣品取播種3月齡（90 d）的葉片、葉柄、球莖及根。所有樣品均設置3次生物學重復，液氮速凍后于–80℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 使用植物多糖多酚總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP441]提取所有樣品的總RNA，提取方法參照試劑盒說明書。使用TIANScript Ⅱ cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，KR107]將提取的總RNA反轉錄成cDNA第1鏈。cDNA合成反應參照試劑盒說明書進行。

1.2.2 CeAGP基因家族的克隆 以芋球莖和葉片cDNA為模板，根據前期全長轉錄組的注釋信息，獲得6個編碼芋AGPase基因的序列，根據序列信息設計特異性克隆引物（表1）。PCR擴增反應體系如下：2×Phanta?Master Mix 20 4.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，雙蒸水補足至40.0 μL。PCR反應程序如下：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸5 min。擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。將目的片段純化、回收后連接到pMD 19-T Vector（TaKaRa，6013）上，然后轉化DH5a化學感受態細胞，涂布在LB（100 mg/L Amp）平板上。以M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer引物對挑取的單克隆進行PCR鑒定，將陽性克隆送廣州艾基生物公司測序。

1.2.3 CeAGP家族蛋白的生物信息學分析 利用NCBI的ORF Finder在線工具（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）查找分析CeAGP家族蛋白的開放閱讀框（ORF）；使用ExPASy- ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預測CeAGP家族蛋白的分子質量和等電點；利用 WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）預測CeAGP家族蛋白的亞細胞定位；使用MEME 5.4.1軟件（https://meme-suite.org/meme/）分析CeAGP 家族蛋白的保守motif，然后使用InterProScan數據庫（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）對預測的motif進行功能注釋。

表1 基因克隆和熒光定量RT-PCR引物

1.2.4 CeAGP蛋白的系統進化樹構建 目前，許多植物的AGPase基因家族已經被鑒定，可用于本研究進行系統進化分析。從Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站下載擬南芥、水稻、馬鈴薯、甘薯和木薯的AGPase蛋白序列，然后利用DNAMAN 9對芋、擬南芥、水稻、馬鈴薯、甘薯和木薯的AGPase蛋白進行多重序列比對，采用MEGA X的NJ法（Bootstrap值為1000次）構建系統進化樹。

1.2.5 CeAGP基因家族的轉錄組分析 課題組前期研究中對芋球莖發育過程中淀粉的含量進行了測定，發現在球莖發育前期（1～2月齡，即S1、S2），淀粉含量較低，在發育中期（3～5月齡，即S3、S4、S5）淡粉迅速積累，發育后期（6～8月齡，即S6、S7、S8）淀粉含量保持穩定[22]。因此，根據球莖淀粉的積累規律，對芋球莖發育1、2、3、4、5和8月齡（TS1、TS2、TS3、TS4、TS5、TS6）的球莖樣品開展了全轉錄組測序，富集了大量與淀粉和蔗糖代謝相關的mRNA、miRNA和CircRNA[22]。隨后，同樣基于淀粉的積累規律，對芋球莖發育3月齡的不同組織葉片、葉柄、球莖和根也開展了轉錄組測序（未發表）。本研究從兩組轉錄組數據中提取6個CeAGP基因的FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）值，在百邁克云平臺（https://international. biocloud.net/zh/software/tools/detail/small/305）繪制CeAGP基因家族在不同組織和球莖不同發育階段的聚類熱圖。

1.2.6 CeAGP基因家族的表達分析 以葉片、葉柄、根和球莖不同發育階段的cDNA為模板，使用AnalytikJena qTOWERE 2.2熒光定量PCR儀進行熒光定量RT-PCR試驗。根據克隆獲得的芋CeAGP基因家族序列，利用Primer 5.0設計熒光定量RT-PCR引物（表1），以芋基因為內參基因[5]。使用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，Q711-02）進行熒光定量RT-PCR試驗，試驗過程按照試劑盒說明書進行操作。反應體系為：SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，模板cDNA 1.0 μL，雙蒸水補足至20.0 μL。熒光定量RT-PCR反應程序如下：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸20 s，共45個循環。每個樣品3次重復。采用2?ΔΔCT法計算基因的相對表達量[23]。

2 結果與分析

2.1 CeAGP基因家族cDNA序列克隆

以芋球莖和葉片總RNA反轉錄所得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到長度為1316～2028 bp的目的基因片段（圖1），經連接、轉化及菌落PCR鑒定，得到陽性克隆。通過測序、拼接獲得6個芋AGPase基因的cDNA序列，序列長度為1398～2028 bp（表2），其中編碼AGPase大亞基的基因4個，將其命名為、、和；編碼AGPase小亞基的基因2個，將其命名為和。將獲得的基因核苷酸序列提交至NCBI數據庫，獲得相應的GenBank登錄號（表2）。

M: Marker III; 1: CeAGPL1 1F1R; 2: CeAGPL2 1F1R; 3: CeAGPL3 1F1R; 4: CeAGPL4 1F1R; 5: CeAGPL4 2F2R; 6: CeAGPS1 1F1R; 7: CeAGPS2 1F1R.

表2 CeAGP家族蛋白的理化性質

2.2 CeAGP家族蛋白的理化性質預測

對克隆獲得的CeAGP基因家族編碼的蛋白大小進行分析，結果表明，6個CeAGP基因家族編碼的蛋白大小為350～543 aa（表2）。對CeAGP基因家族編碼的蛋白進行理化性質預測，結果見表2，CeAGP家族蛋白分子質量范圍為38 753.22～ 59 743.05 kDa，等電點范圍為5.64～8.82，CeAGP家族蛋白預測的亞細胞位置主要有葉綠體、淀粉體和細胞質等。

2.3 CeAGP家族蛋白的系統進化分析

為了研究CeAGP家族蛋白的進化關系，用36個AGPase蛋白用于系統進化研究，其中包括6個水稻OsAGP，6個擬南芥AtAGP，5個馬鈴薯StAGP，7個木薯MeAGP，6個甘薯IbAGP和6個芋CeAGP。系統進化分析顯示，所有的AGPase被分成大亞基和小亞基2個群組（圖2）。大亞基群組包含23個AGPase蛋白，其中包括4個水稻OsAGP（OsAGPL1：LOC_Os03g52460；OsAGPL2：LOC_Os01g44220；OsAGPL3：LOC_ Os05g50380；OsAGPL4：LOC_Os07g13980），4個擬南芥AtAGP（AtAGPL1：AT5G19220；At-A-GPL2：AT1G27680；AtAGPL3：AT4G39210；At--A-GPL4：AT2G21590），3個馬鈴薯StAGP（St-A-GPL1：PGSC0003DMG400009026；StAGPL2：PG-SC0003DMG400015952；StAGPL3：PGS-C-000-3-D-MG400000735），4個木薯MeAGP（MeAGPL1：Man-es.01G236700；MeAGPL2：Manes.03-G-18-2-1-00；MeAGPL3：Manes.11G085500；MeAGPL4：Manes.15G025400），4個甘薯IbAGP（IbAGPL1：JQ797692；IbAGPL2：JQ797693；IbAGPL3：JQ797694；IbAGPL4：JQ797695）和4個芋CeAGP；小亞基群組包含13個AGPase蛋白，其中包括2個水稻OsAGP（OsAGPS1：LOC_Os09g12660；OsAGPS2：LOC_Os08g25734），2個擬南芥AtAGP（AtAGPS1：AT5G48300；AtAGPS2：AT1G0-5610），2個馬鈴薯StAGP（StAGPS1.1：PGSC0003-DM-G400031084；StAGPS1.2：PGSC0003D-MG-400046891），3個木薯MeAGP（MeAGPS1：Man-es.-05-G2080-00；MeAGPS2：Manes.12G067900；MeAGPS3：Manes.13G058900），2個甘薯IbAGP（IbAGPS1：JQ797696；IbAGPS2：JQ797697）和2個芋CeAGP（圖2）。

由圖2可知，在芋CeAGP小亞基蛋白中，CeAGPS2與AtAGPS2和MeAGPS1形成的分支聚在一起，形成了一個單獨的進化分支；而CeAGPS1與OsAGPS1和OsAGPS2的親緣關系更近。在芋Ce-A-GP大亞基蛋白中，CeAGPL1和CeAGPL4聚在一個分支上，然后與IbAGPL3、StAGPL2和AtA-G--PL2形成的分支聚在一起；CeAGPL2與MeAGPL1聚在一個分支上，說明彼此的親緣關系更近；Ce-A-GPL3與AtAGPL1、StAGPL1、IbAGPL4、Me-A-GPL2和MeAGPL4形成的分支聚在一起（圖2）。

圖2 水稻、擬南芥、馬鈴薯、甘薯、木薯和CeAGP家族蛋白的系統進化分析

2.4 CeAGP家族蛋白的保守motif分析

為了進一步分析CeAGP家族蛋白的結構多樣性和功能，使用MEME 5.4.1軟件和InterPro數據庫對CeAGP家族蛋白的保守motif進行預測和功能注釋（圖3和表3）。結果顯示，共預測到11個保守motif，6個motif（motif 1，4～8）注釋為NTP_transferase（PF00483）；CeAGPL1、CeAGPL2、CeAGPL3、CeAGPL4和CeAGPS1包含所有的11個motif；而CeAGPS2包含motif 2～5和motif 8～11，缺少了motif 1、motif 6、motif 7。

2.5 CeAGP基因家族在轉錄組測序中的表達分析

為了研究CeAGP基因家族在芋生長發育中的功能，根據課題組前期對芋球莖淀粉的積累規律，對球莖發育3月齡植株的不同組織（葉片、葉柄、球莖和根）和球莖不同發育階段（1、2、3、4、5和8月齡）的樣品進行了轉錄組測序，從轉錄組數據中提取6個CeAGP基因家庭成員的FPKM值，對CeAGP基因在芋不同組織和球莖不同發育階段的表達情況進行分析。

由圖4和表4可看出，在球莖、葉片和葉柄中高表達，其中最高的為球莖，FPKM值為887.11，其次為葉片和葉柄，FPKM值為327.53和164.35，根的表達量最低，FPKM值僅為15.97；在球莖中高表達，FPKM值為851.76，在葉片、葉柄和根中低表達，FPKM值≤40.07；在葉片和葉柄有較高的表達量，FPKM值分別為323.51和131.76，在球莖和根中低表達，FPKM值≤13.58；、和在所有的組織中均有表達，但表達量較低，FPKM值≤25.66。由于高等植物的AGPaes是由2個大亞基和2個小亞基組成的異源四聚體，大亞基和小亞基由不同的基因編碼產生[10]。從基因家族在芋不同組織的表達情況發現，在球莖中，和基因高表達且表達量基本一致，遠高于其他4個基因，說明球莖AGPase主要是由和基因編碼產生的多肽形成；在葉片和葉柄中，和基因高表達且表達量基本一致，遠高于其他4個基因，說明葉片和葉柄AGPase主要是由和基因編碼產生的多肽形成。此外，球莖和基因的整體表達量高于葉片和的整體表達量，葉片的和整體表達量又高于葉柄的和的表達量，推測芋球莖、葉片和葉柄均具有合成淀粉的能力，且合成能力大小為球莖>葉片>葉柄。

圖3 CeAGP家族蛋白的系統進化和保守motif分析

表3 芋CeAGP家族蛋白保守motif及功能注釋

圖4 CeAGP基因家族在芋不同組織的表達分析

由圖5和表5可看出，表達呈逐漸升高后降低的趨勢，其中表達最高的是TS5（5月齡)，FPKM值為691.48，其次為TS4（4月齡），FPKM值為558.03；的表達趨勢與一致，均為逐漸升高后降低的趨勢，其中表達量最高的為TS4（4月齡），FPKM值為361.34；、、和在球莖不同發育階段的表達量均較低，FPKM值≤40.99。在球莖發育過程中，僅有和基因高表達，與基因家族在不同組織的表達結果一致。

表4 CeAGP基因家族在芋不同組織的FPKM值

圖5 CeAGP基因家族在芋球莖不同發育階段的表達分析

2.6 CeAGP基因家族的熒光定量表達分析

為了驗證轉錄組測序的結果，選取了3月齡植株的葉片、葉柄、球莖和根4種組織及球莖8個不同發育階段（1、2、3、4、5、6、7、8月齡）的樣品，對CeAGP基因家族在不同組織和球莖不同發育階段的表達情況進行分析。由圖6可知，在不同組織中，在球莖的表達量最高，顯著高于其他組織（<0.05），其次為葉片和葉柄，顯著高于根的表達（<0.05）；在球莖顯著表達（<0.05）；在葉片中的表達量最高，顯著高于其他組織（<0.05），其次為葉柄；雖然、和在不同組織均能表達，但整體表達量較低。在球莖不同發育階段中（圖7），的表達呈先升高后降低的趨勢，在S5（5月齡）階段的表達量最高（<0.05）；的表達也是呈現先升高后降低的趨勢，在S4（4月齡）階段表達量最高；、、和在球莖不同發育階段的表達量雖然存在差異，但整體表達量較低。6個CeAGP基因家族成員在不同組織和球莖不同發育階段的表達趨勢與轉錄組測序的結果一致。

表5 CeAGP基因家族在芋球莖不同發育階段的FPKM值

3 討論

AGPase是淀粉生物合成途徑的第一個限速酶，在調控植物生長發育、應對環境脅迫等方面發揮重要作用[20]。本研究根據前期對芋3月齡植株不同組織（葉片、葉柄、球莖和根）的混合樣進行了全長轉錄組測序，序列經與芋參考基因組進行比較，獲得功能注釋信息，其中有6個基因注釋為AGPase基因。根據序列信息，設計特異性克隆引物，克隆獲得了6個AGPase基因的cDNA序列，包括4個大亞基基因（～）和2個小亞基基因（，）。克隆的芋AGPase基因家族個數與馬鈴薯、擬南芥、玉米和甘薯上報道的AGPase基因個數一致[11, 15-17]，與番茄、獼猴桃、西谷椰子、水稻、木薯和香蕉等鑒定的AGPase基因個數存在差異[9, 12-14, 18-20]，至于芋中是否還存在其他AGPase基因，仍需進一步通過全基因組范圍內開展基因家族鑒定和分析。

系統進化分析顯示，所有的AGPase蛋白分成了大亞基和小亞基2個群組，芋的4個大亞基分在了大亞基組，2個小亞基分在了小亞基組，這與木薯、香蕉的AGPase系統進化分析結果一致[9, 20]。6個CeAGP蛋白共預測到11個保守motif，與其他植物AGPase預測的motif略有差異，如香蕉上共預測到15個motif，木薯上預測到20個motif[9, 20]。所有的CeAGP蛋白中，CeAGPS2包含8個motif，其余5個CeAGP蛋白均包含11個motif，推測CeAGPS2可能在進化歷史和行使功能方面與其他5個CeAGP蛋白存在差異。在香蕉AGPase上也存在類似情況，6個MaAPL包含15個motif，而MaAPS1包含11個motif，MaAPS2僅包含9個motif[20]。雖然4個CeAGPL與CeAGPS1有著相同的motif，但可能在基因內含子和外顯子結構方面存在差異，在其他植物如香蕉、蓮、小麥、甘薯等均發現AGPase的大亞基和小亞基基因在內含子和外顯子結構方面存在差異[10-11, 20, 24]。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

在普遍認知中，葉片合成淀粉的場所為葉綠體，而在貯藏器官（塊莖）合成淀粉的場所為淀粉體，因而AGPase也主要存在于葉綠體和淀粉體中[16-17]。此外，也有相關研究表明，AGPase不僅存在于質體中，也存在于細胞質，如水稻AGPase亞細胞定位中，OsAGPS2a、OsAGPS1、OsAGPL1、OsAGPL3和OsAGPL4定位于質體，而OsAGPS2b和OsAGPL2定位于細胞質中[25]；玉米胚乳AGPase以質外體為主[26]；香蕉果肉AGPase存在于細胞質和淀粉體中，且在細胞質中活性大于淀粉體[27]。在本研究中，CeAGP家族蛋白預測的亞細胞位置主要有葉綠體、淀粉體和細胞質等，預測結果與上述研究結果一致，至于每個CeAGP更加精細的亞細胞定位，仍需進一步的實驗驗證。

在芋不同組織中，在球莖中高表達，在葉片和葉柄高表達，在球莖葉片和葉柄中的表達量均較高，而、和在所有組織中的表達量均較低，說明不同的CeAGP基因在不同組織的表達模式上存在差異。其他植物AGPase基因也存在類似情況，如木薯在葉片高表達，在貯藏根中高表達，而在貯藏根和葉片中均高表達[9]；香蕉和在果實上高表達，在葉片和果實高表達，而在所有組織中的表達量均較低[20]。同時，從CeAGP基因家族在芋不同組織的表達情況發現，在球莖中，和基因高表達；而在葉片和葉柄中，高表達的基因為和，說明芋球莖AGPase與葉片和葉柄AGPase由不同的基因編碼產生，推測芋球莖與葉片和葉柄在淀粉合成方式上存在差異，這與VAN HARSSELAAR等[16]報道的馬鈴薯在葉片和塊莖中有不同的淀粉合成方式一致。

在芋球莖不同發育過程中，和的表達量均表現先升高后降低的趨勢，在中后期表達量最高，其余4個基因的表達量均較低。王立等[5]對芋AGPase小亞基基因在球莖發育過程中的研究結果表明，該基因的表達呈現先升高后降低的趨勢，在播種后160 d表達水平最高，與本研究結果一致。在本課題組前期研究中，對球莖發育過程中淀粉的積累結果表明，在球莖發育前期（1～2月齡）淀粉含量較低，隨后在接下來的3個月（3～5月齡）淀粉含量迅速增加，最后趨于穩定[22]；同時，（）和（）的轉錄水平在球莖4月齡顯著上調[22]，與本研究結果一致。和在球莖高表達且表達趨勢與淀粉的積累趨勢一致，且與其在不同組織的表達結果相互印證，說明這2個基因可能是球莖淀粉積累的關鍵基因。綜上，本研究克隆獲得6個編碼芋AGPase基因的cDNA序列，序列長度為1398～2028 bp，編碼的蛋白大小為350～543 aa。在葉片和葉柄中，高表達的基因為和；在球莖中，高表達的基因為和，且這2個基因在球莖不同發育階段中均表現先升高后降低的趨勢。相關研究結果為后續闡明芋淀粉合成的分子機制提供依據。

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Cloning, Bioinformatics and Expression Analysis of ADP-glucose Pyrophosphorylase Gene Family in

HE Fanglian1, LIU Lili2, JIANG Huiping1, QIU Zuyang2, HUANG Shiyu1, DONG Weiqing1*

1. Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricutural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China; 2. Lipu Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Lipu, Guangxi 546600, China

Taro () is a member of the genusin the family Tenaxaceae and is widely grown worldwide, and the main storage material of its corm is starch.ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) is the first key and rate-limiting enzyme for starch synthesis and plays a critical role in plant starch synthesis, but the molecular structural features and expression patterns of the taro AGPase gene family are still unclear.In this study, six AGPase genes were selected from the full-length transcriptome annotations using the new taro variety ‘Lipuyu No.1’ as the test material. The coding regions of the six genes were cloned by RT-PCR, and the physicochemical properties, evolutionary relationships and conserved motifs were analyzed by bioinformatics.The results showed that the cDNA sequences of the coding regions of six taro AGPase genes were ranged from 1398 bp to 2028 bp and the proteins encoded were ranged from 350 aa to 543 aa in size, of which four genes (to) encoded large subunits of AGPase and two genes (,) encoded small subunits of AGPase. Phylogenetic analysis showed that all AGPases were divided into two groups, large and small subunits, with four large subunits in the large subunit group and two small subunits in the small subunit group. The molecular mass of CeAGPfamily proteins ranged from 38 753.22 kDa to 59 743.05 kDa, with an isoelectric point range of 5.64 to 8.82 and subcellular localization to chloroplasts, amyloplasts and cytoplasm, etc.The conserved motif analysis of the proteins revealed that a total of 11 conserved motifs were predicted for CeAGP family proteins, six motifs were functionally annotated as NTP_transferase, and the other five CeAGP proteins contained 11 motifs except for CeAGPS2.In different tissues, all sixgenes were expressed in all tissues, with high expression ofandin leaves and petioles, high expression ofandin corms, and low expression of all sixgenes in roots.andwere highly expressed in different developmental stages of the corm and both showed a tendency to increase and then decrease, with the highest expression of both genes at 4 and 5 months of age, respectively. These results provide a basis for the subsequent elucidation of the mechanism of taro starch synthesis.

; AGPase; gene cloning; expression analysis

S961.6

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.08.004

2022-02-10；

2022-03-03

廣西重點研發計劃項目（桂科AB20297041）；廣西農業科學院科技發展基金項目（桂農科2021JM82）；廣西荔浦芋試驗站（No. TS202113）。

何芳練（1988—），男，碩士，助理研究員，研究方向：芋種質資源創新利用與遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：董偉清（DONG Weiqing），E-mail：dongweiqing@gxaas.net。