鹽度對哈維弧菌耐藥性的影響及耐藥基因gyrB的表達實驗研究

陳秀程, 王江勇, 孫敬鋒

鹽度對哈維弧菌耐藥性的影響及耐藥基因的表達實驗研究

陳秀程1, 2, 王江勇1,*, 孫敬鋒2

1. 惠州學院, 惠州 516007 2. 天津農學院, 天津 300384

為研究不同鹽度對哈維弧菌生理生化和耐藥性的影響, 探討不同鹽度對哈維弧菌的耐藥表型與攜帶耐藥基因的變化, 以哈維弧菌9H7R為主要研究對象, 在鹽度為 5、10、15、20、25 ppt下, 采用紙片擴散法(Kirby-Bauer紙片擴散法, 簡稱K-B法), 參照NCCLS抗生素敏感試驗操作標準, 研究哈維弧菌在不同鹽度下耐藥性的變化。然后提取細菌 RNA、經反轉錄及 qPCR,再根據特定基因計算相對表達量。結果顯示: 不同鹽度生長的哈維弧菌, 對喹諾酮類藥物的耐藥性發生了變化, 且耐藥基因的表達量受到了影響。

哈維弧菌; 鹽度; 抗生素; 耐藥性; 熒光定量PCR

0 前言

哈維弧菌()是水產養殖動物重要的條件致病菌, 廣泛存在于海洋環境中, 主要是存在于自由水體、浮游動植物體表、海底沉積物中, 在25 ℃—37 ℃的溫度范圍快速繁殖, 具有嗜鹽性, 在鹽度較高水域存活[1]。高密度生長哈維弧菌時會呈現發光現象, 可同時感染多種水生動物, 可引起雜色鮑()肌肉萎縮癥[2], 感染對蝦“發光弧菌病”、大黃魚弧菌病等, 感染哈維弧菌病, 病魚呈現眼球突出、肌肉潰爛、內臟壞死等癥狀并導致其死亡, 對海水養殖業造成巨大的損失。哈維弧菌作為病原菌具有致病性強、傳播速度快、流行范圍廣、死亡率高等特點。目前對哈維弧菌病的防治主要是采用抗菌藥物(如復方新諾明和喹諾酮類藥物等)。抗生素是指能夠殺死病原菌或抑制其生長, 對人體或動物本身沒有毒性的一類藥物。隨著抗生素在養殖動物中的大量應用, 哈維弧菌對抗生素的耐藥性日益嚴重, 吳立婷等[3]從病死的大黃魚中, 分離并鑒定出 54 株哈維弧菌, 藥敏結果表明對復方新諾明和阿莫西林等的敏感范圍顯示耐藥, 對 13 種抗生素產生高耐藥性, 耐藥菌株占總菌株量的37%。Stalin等[4]從印度孟加拉灣東海岸的黑虎蝦塘和海岸的水體懸浮沉積物樣品中分離并鑒定出5株哈維弧菌, 其中3株來自各類蝦塘, 2株來自沿海地區進行了15種抗生素的分析,結果顯示與其他檢測抗生素相比, 哈維弧菌對環丙沙星、青霉素、利福平和萬古霉素具有耐藥性。已有的報道表明在貝類中弧菌的污染率較高[5], 多種疾病通常是由弧菌屬病原菌引起的[6]。然而抗生素的大量使用導致海水養殖源弧菌產生嚴重的耐藥性。王瑞旋等分離鑒定了來自海南鮑魚足膿腫病的哈維弧菌, 報道哈維弧菌對卡那霉素和克林霉素有耐藥性[7]。Kang等[8]從韓國西海以及貝類養殖場附近收集的海水中分離并鑒定出哈維弧菌, 840份海水樣品中分離出2株哈維弧菌, 選定16種抗生素進行了分析, 發現它們對頭孢霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢替坦和鏈霉素具有耐藥性；Stalin等研究印度東南沿海對蝦養殖環境中的哈維弧菌耐藥性得出, 全部菌株對氨芐青霉素、頭孢克洛、慶大霉素、諾氟沙星耐藥[9]。其中喹諾酮類藥物在水產養殖業中應用廣泛, 水產養殖環境中的細菌對此類藥物的耐藥性日趨顯著。哈維弧菌在無鹽培養基中不生長, 在含鹽營養瓊脂平板上生長良好, 28 ℃培養 24 h 可以形成圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、閃光的菌落, 在TCBS 平板上為黃色菌落, 4 ℃以下和 40 ℃以上不能生長[10], pH值在5.0—7.9都可以正常生長。由于哈維弧菌的嗜鹽性, 在高鹽度下, 哈維弧菌生長數量增加, 抗生素用量增大會使耐藥性發生改變, 不同抗生素的使用也會影響細菌耐藥性的改變[11]。不同細菌之間會發生耐藥性的傳遞, 會導致耐藥性的改變, 且來源不同環境下的哈維弧菌耐藥性不同[12]。

本研究針對不同鹽度下的哈維弧菌進行耐藥分析, 采用Kirby-Bauer紙片擴散法(簡稱K-B 法)和特定耐藥基因的檢測(qPCR: 實時熒光定量PCR), 模擬鹽度影響因子, 在細菌生長量、特定基因的分子水平分析細菌耐藥性變化。本文的研究結果為不同鹽度下對海水養殖動物細菌病的藥物防控提供理論依據, 同時為細菌耐藥性的深入研究提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用哈維弧菌是從2014年6月廣東省某鮑魚養殖場患膿皰病的鮑魚中分離的, 經過誘導后為9H7R保存于-80 ℃。本實驗從2019年8月起到2020年1月。細菌DNA抽提試劑盒(廣州邁寶生物科技有限公司)；RNA試劑盒(廣州邁寶生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒(TaKaRa)；藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)營養瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)；Premix(貨號RR901A 50 μL反應*120次TaKaRa)；生理鹽水(100 mL去離子水中加入0.85 g或0.9 g氯化鈉, 高壓滅菌)；1%瓊脂糖凝膠。耐藥基因gyrB為文獻中所提供[13]。主要儀器: 電泳儀(美國Bio-Rad公司)、超凈工作臺、凝膠成像儀、移液槍、旋渦混合器、PCR 儀(日本TaKaRa公司)、熒光定量PCR儀(Lightcycler 480)、0.5 麥氏比濁管、平板、NanoDrop 2000超微量分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 不同鹽度下生理生化特性分析

用營養瓊脂培養基活化哈維弧菌, 28 ℃培養24 h, 接種到斜面培養基待培養17—24 h, 長出菌苔用8.5 ppt的無菌生理鹽水洗脫。用0.5 麥氏比濁管比濁, 稀釋成1.5×108cfu·mL-1的菌液分別在5、10、15、20、25 ppt鹽度的LB固體培養基上均勻涂平, 倒置培養箱生長24—48 h, 做多組平行, 對生長后菌株大小進行比較, 選擇優勢菌測量, 對不同鹽度生長的哈維弧菌數量比較, 選擇平均四分區域法計量哈維弧菌數量, 平行取典型兩組比較。生化鑒定將生長的斜面菌苔用3 mL, 8.5 ppt無菌生理鹽水洗脫, 用0.5麥氏比濁管比濁, 加無菌生理鹽水稀釋成約1×108cfu·mL-1, 用吸管吸取2 滴(約0.06 mL)菌懸液加入每種微量生化管內, 進行分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇發酵試驗, 糖產氣實驗等。放置培養溫度為37 ℃的培養箱中, 設置固定的培養時間, 觀察培養后的結果。

1.2.2 不同鹽度下哈維弧菌藥物敏感性測試

選用常用藥敏紙片法(k-b 法), 四環素類、利福霉素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、β—內酰胺類、大環內酯類等抗生素按常規進行藥敏試驗, 參照 NCCLS 抗生素敏感試驗操作標準及相關研究文獻進行[14-16]。用 1 mL生理鹽水洗脫已培養 17—24 h 斜面的哈維弧菌菌苔, 對照麥氏比濁管調整菌懸液濃度約為1.5×108cfu·mL-1, 取 300 μL 菌液均勻涂布于 Mueller-Hinton(MH)瓊脂平板上, 放置 4—5 min, 用無菌小鑷子分別取藥敏紙片按要求均勻緊貼于培養基表面(每個方形平板培養基最多貼 16 張紙片, 藥敏紙片直徑為7 mm, 吸水量為 20 μL[17], 相鄰紙片等距離> 20 mm, 紙片距離培養基邊界> 15 mm。倒置于 28 ℃生化培養箱中培養24—48 h后, 用游標卡尺測量抑菌圈直徑[18]。根據美國臨床試驗室國家標準化管理委員會(CLSI2008)標準判定結果, 對照相關參照將敏感范圍分為(S)、中度(I)、耐藥(R)三個區間。判定標準詳見表1。

1.2.3 耐藥基因檢測及總RNA的提取

根據哈維弧菌的耐藥表型, 選擇與喹諾酮類耐藥的基因為研究分子, 對五種不同鹽度生長的哈維弧菌進行DNA提取, 參照試劑盒說明提取, PCR鑒定, 基因的反應條件95 ℃預變性 5 min, 95 ℃變性 1 min, 53.5 ℃復性 1 min, 72 ℃延伸 30 s, 30 個循環, 72 ℃延伸 10 min。電泳儀確定條帶(1%瓊脂糖凝膠0.5×TBE配制), 初步確定基因。

RNA提取參照試劑盒使用說明書, 鹽度處理培養后的菌液各取３ mL離心, 接著溶菌、裂解、漂洗、洗脫緩沖、測總RNA的濃度和A260/A280、RNA溶液放置-80℃冰箱保存或直接反轉錄(根據試劑盒說明進行)。PCR反應體系為20 μL: Premix 2 × Ex Taq 10 μL, DNA 模板 2 μL, 上下游引物0.8 μL, dH2O 6.4 μL。

1.2.4 相對定量雙△Ct法

耐藥基因相對表達水平2ΔΔ(Ct), Δ=()()；

Δ(Δ)=Δ(實驗組)(對照組)。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度對哈維弧菌生長的影響及生化鑒定

2.1.1 哈維弧菌生長影響

根據不同鹽度生長的哈維弧菌, 在培養箱中生長24—48 h, 觀察細菌個體, 進行優勢菌株直徑測量, 測量結果顯示菌株隨生長鹽度的增加, 菌株越大, 采用平板計數法, 發現鹽度在25時, 菌株數最多, 鹽度為20的培養基生長的哈維弧菌數量較少, 細菌數量由多到少的相對應鹽度顯示: 25 ppt、10 ppt、5 ppt、15 ppt、20 ppt。本次結果表明, 高鹽度生長的哈維弧菌數量較多, 菌株較大, 細菌生長速度較快；低鹽度下生長的哈維弧菌數量相對少, 菌株偏小, 生長速度較慢。哈維弧菌的生長量及在不同鹽度處理下菌株大小通過多組平行比較的統計具有研究意義。結果見表3。

表1 藥物敏感性判斷標準

表2 耐藥基因的引物序列

2.1.2 哈維弧菌生化鑒定結果

5種不同鹽度生長的哈維弧菌, 生化特性基本一致, 其中包括葡萄糖產氣、肌醇、阿拉伯糖、蔗糖、甘露糖等生化指標均保持一致。1%NaCl葡萄糖磷酸鹽胨水, 在15 ppt鹽度和20 ppt鹽度生長的哈維弧菌與其他鹽度哈維弧菌生化鑒定結果有區別, 鹽度為5 ppt、10 ppt、25 ppt的生長弧菌呈現多陽性現狀, 在15 ppt鹽度和20 ppt鹽度生長的哈維弧菌生化管繼續滴入一滴試劑, 結果顯示與鹽度為5 ppt、10 ppt、25 ppt的生長弧菌結果一致。因此, 不同鹽度下生長的哈維弧菌, 生化特性不會發生變化。詳見表4。

2.2 不同鹽度培養的哈維弧菌藥敏結果

經藥敏試驗鑒定, 不同鹽度下培養的哈維弧菌耐藥性發生變化。哈維弧菌在不同鹽度下對阿奇霉素、氧氟沙星耐藥性變化大, 敏感范圍發生明顯變化, 鹽度為15 ppt和25 ppt時菌株對阿奇霉素敏感范圍顯示中度敏感, 其他鹽度生長的哈維弧菌對阿奇霉素為敏感, 5 ppt鹽度的哈維弧菌對氧氟沙星顯示中度敏感, 其他鹽度生長的哈維弧菌顯示耐藥, 阿奇霉素屬于大環內酯類, 氧氟沙星屬于喹諾酮類抗生素。發現哈維弧菌對喹諾酮類耐藥, 篩選出的藥物有諾氟沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星、環丙沙星。此外, 哈維弧菌對阿莫西林、氨芐西林、青霉素、頭孢哌酮等耐藥。詳細結果表5。

表3 哈維弧菌在不同鹽度培養的平板計數比較

表4 5種鹽度下哈維弧菌分離株生化試驗結果

注: a1. 5 ppt鹽度的培養菌株; a2. 10 ppt鹽度的培養菌株; a3. 15 ppt鹽度的培養菌株; a4.20 ppt鹽度的培養菌株; a5. 25 ppt鹽度的培養菌株; +. 多為陽性; –. 少數陽性; d.結果不確定; (+). 弱陽性。

表5 不同鹽度培養的哈維弧菌藥敏結果

注: a1.5 ppt鹽度的培養菌株; a2.10 ppt鹽度的培養菌株; a3. 15 ppt鹽度的培養菌株; a4. 20 ppt鹽度的培養菌株; a5. 25 ppt鹽度的培養菌株。

2.3 不同鹽度處理的哈維弧菌熒光PCR結果

2.3.1 哈維弧菌提取DNA及PCR鑒定實驗結果

取培養的哈維弧菌提取DNA, 選取基因引物, 經過PCR鑒定, 在電泳儀上觀察條帶, 產物長度為234 bp且為一條清晰的條帶與基因相符(設計了八個平行梯度的退火溫度, 分別是64.0 ℃、63.1 ℃、61.6 ℃、59.3 ℃、56.6 ℃、54.3 ℃、52.8 ℃、52.0 ℃), 送天一公司測序, 結果顯示與哈維弧菌相似度最高, 證明哈維弧菌中含有基因如圖1所示。

2.3.2 熒光PCR鑒定基因結果

不同鹽度處理后的哈維弧菌中RNA顯示的A260/A280比值為1.80—2.20。當基因在不同鹽度的處理下, 鹽度在5 ppt時,基因的Ct值最小(反應管內熒光信號達到設定的閾值所經歷的循環數), 因此表明表達量最高, 符合藥敏試驗結果。詳細結果見表6。

圖1 PCR產物凝膠電泳圖

Figure1 The PCR products of Agarose gel electrophoresis

3 討論

3.1 不同鹽度培養對哈維弧菌生理生化影響

哈維弧菌感染對象廣泛, 可引起大黃魚、斜帶石斑魚、對蝦、雜色鮑等經濟動物的大規模爆發疾病。二十世紀至今, 哈維弧菌導致的感染給世界范圍內的水產養殖場帶來嚴重的經濟損失[19]。由于哈維弧菌嗜鹽, 在不同鹽度條件下, 哈維弧菌菌株生長具有差異性。因此本實驗設計五種不同鹽度生長細菌, 進行比較, 鹽度因素對細菌生理生長的影響, 在25 ppt鹽度下生長的哈維弧菌菌株直徑最大, 細菌量多, 5 ppt鹽度生長的哈維弧菌菌株直徑小且生長緩慢, 細菌數量較少。生化鑒定結果顯示, 在不同鹽度下生長的哈維弧菌生化指標不變, 說明鹽度條件不影響生化特性。在不同鹽度下, 哈維弧菌的生長形態上發生明顯變化。因此, 在培養哈維弧菌時選擇較高鹽度培養基, 在對細菌不同鹽度的培養, 實際生產中可用來控制細菌的生長量, 減少水產養殖業的細菌感染。在生化鑒定上, 不同鹽度生長的哈維弧菌生化特性沒有影響, 因此在生化鑒定能夠準確確定細菌種類, 為防治細菌病的研究提供依據。

表6 不同鹽度培養的哈維弧菌的內參基因、目的基因的Ｃt 比較

3.2 不同鹽度培養下哈維弧菌耐藥性的差異

通過藥敏紙片法在不同鹽度生長的哈維弧菌抑圈直徑的比較, 判定耐藥范圍變化, 最終確定耐藥性的變化, 這種方法能夠快速檢測細菌之間耐藥性表型變化。藥敏結果顯示, 哈維弧菌對諾氟沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星的喹諾酮類耐藥且在不同鹽度下生長的哈維弧菌對氧氟沙星敏感范圍發生明顯變化, 5 ppt鹽度下生長的哈維弧菌對氧氟沙星顯示中度敏感, 其他鹽度下的哈維弧菌顯示耐藥。

對應選定的喹諾酮類耐藥基因, 檢測到哈維弧菌中存在該耐藥基因, 對不同鹽度培養的哈維弧菌的耐藥基因進行相對定量檢測, 從細菌的耐藥基因型變化, 確定耐藥性的變化。鹽度為5 ppt生長的哈維弧菌,基因的Ct值最小, 表達量顯示最高, 其它鹽度生長的哈維弧菌耐藥基因的Ct值較高, 顯示的表達量偏低, 與藥敏試驗結果一致。實驗表明, 不同鹽度生長的哈維弧菌耐藥性會發生改變, 因此, 在調節鹽度條件可改變哈維弧菌的耐藥性, 通過這種特性, 在對哈維弧菌耐藥性的研究, 可以采取對鹽度的調控, 在哈維弧菌感染病的防治上有一定的作用。

2012年—2014年中國南海海水養殖魚類病原菌哈維弧菌分離株的耐藥性分析中, 報道了海南和廣東地區分離株對環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星抗生素敏感性高, 對阿莫西林、呋喃唑酮的耐藥率高, 顯示哈維弧菌對喹諾酮類藥物具有高敏感性[20]。不同鹽度影響下, 哈維弧菌對喹諾酮類抗生素耐藥性變化大, 可能是海水養殖中喹諾酮類抗生素使用較多, 從而影響了細菌耐藥性, 1994年氟喹諾酮被我國準許投入使用, 是在動物上首個被使用的喹諾酮類藥物[21]。有報道認為氧氟沙星是治療急性菌痢的首選藥物, 有效率可達90%[22]；唐建華等關于氧氟沙星藥物的研究進展中提到氧氟沙星大的量使用, 造成了嚴重危害[23]。本實驗不同鹽度下培養的哈維弧菌對氧氟沙星的敏感范圍不同, 這可能由于氧氟沙星的大量使用, 使哈維弧菌的耐藥性發生變化。

4 結論

研究結果表明, 受鹽度因素影響, 哈維弧菌在培養基上的菌落形態及細菌數量會發生變化, 這種特性可以作為控制細菌生長的重要因素；結合藥敏試驗及qPCR檢測結果, 哈維弧菌對喹諾酮類抗生素顯示耐藥, 且不同鹽度下細菌的耐藥性不同, 實驗結果可為海水動物細菌病的防控提供參考。

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Studies on the influence of salinity in drug resistance ofand the expression experiment of drug resistance gene

Chen Xiucheng1,2,Wang Jiangyong1,*, Sun Jingfeng2

1. Huizhou University, Huizhou 516007, China 2. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China

For the study of different salinity effect on physiological, biochemical and drug resistance of, we investigatec the changes of drug-resistant phenotype and drug-resistant gene ofatdifferent salinity using9H7R; the salinity of seawater was 5, 10, 15, 20, 25 ppt, and Kirby-Bauer paper diffusion method was performed. According to NCCLS antibiotic sensitivity test operation standard, the change of drug resistance ofin different salinity was studied,then bacterial RNA was extracted, reversed transcription and qPCR were performed, and relative expression levelswere calculated according to specific genes.The results showed thatgrew at different salinities.The resistance to quinolones changed and the expression ofwas affected.

; salinity; antibiotics; drug resistance; fluorescence quantitative PCR

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.06.015

S944

A

1008-8873(2022)06-123-07

2020-10-07;

2021-01-17

國家現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-49); 惠州學院教授、博士啟動項目(2020JB065); 廣東省教育廳海洋貝類生態養殖與病害防控創新團隊(2021KCXTD057)

陳秀程(1992—), 女, 江蘇鹽城人, 碩士研究生, 從事貝類病害研究, E-mail: 1369330616@qq.com

通信作者:王江勇, E-mail: wjy104@163.com

陳秀程, 王江勇, 孫敬鋒,等. 鹽度對哈維弧菌耐藥性的影響及耐藥基因的表達實驗研究[J]. 生態科學, 2022, 41(6): 123–129.

Chen Xiucheng, Wang Jiangyong, Sun Jingfeng, et al. Studies on the influence of salinity in drug resistance ofand the expression experiment of drug resistance gene[J]. Ecological Science, 2022, 41(6): 123–129.