WE43鎂合金骨植入對大鼠血液指標、臟器組織學的影響及其體內降解情況▲

張亞男 肖 鵬 孫 瑞 羅亞鴿 謝 文 馮 坤

[1 湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿與康復學院，湖南省長沙市 410208； 2 河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)醫(yī)學檢驗中心，河南省洛陽市 471002； 3 河南省正骨研究院，河南省骨科醫(yī)療器械工程技術研究中心，河南省洛陽市 471002]

生物可吸收鎂合金具有可降解性、生物相容性、骨誘導性等優(yōu)勢，作為骨科醫(yī)用材料被廣泛應用于臨床[1-3]。WE43鎂合金具有良好的力學性能和易加工性，故具有應用于骨生物材料的價值[4-6]。目前有關WE43鎂合金的研究主要集中在體外安全性評價試驗、材料的降解性能和速率等方面，而有關WE43鎂合金骨植入后在體內降解過程中的生物相容性研究并不多。本研究觀察WE43鎂合金骨植入對大鼠血液常規(guī)、肝腎功能的影響，以及WE43鎂合金降解情況，從而探討WE43鎂合金在體內的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物 WE43鎂合金采購自東莞市億諾金屬材料有限公司，元素含量為鎂93.1%、3.8%釔、2.4%釹、0.5%鋯、0.2%鋅，用數(shù)控機床加工成直徑約為2 mm、長度約為4 mm的鎂合金圓柱形試樣，尾部有直徑0.9 mm、深度2 mm的小孔1個，清潔后干熱滅菌備用。12只4月齡SD大鼠購自河南省實驗動物中心[動物許可證號：SYXK(豫)2021-0009]，雌雄各半，單籠喂養(yǎng)，自由進食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～26 ℃，濕度為50%～70%。根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分成對照組和鎂合金植入組，每組6只，雌雄各半。

1.2 股骨髁骨缺損植入方法 飼養(yǎng)大鼠2周后進行手術。鎂合金植入組大鼠術前禁食24 h。采用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，剪毛備皮，進行股骨髁骨缺損植入手術。經(jīng)皮暴露左右兩側股骨髁位置，骨膜下剝離顯露骨質，垂直于骨干方向用電鉆鉆頭鉆出大小為2 mm×4 mm的骨缺損(見圖1)； 把WE43鎂合金試樣植入大鼠的骨缺損處(見圖2)，植入完畢后沖洗并縫合傷口；用碘附消毒，再用紗布包裹縫合部位，以防動物因疼痛而撕咬。術后給予慶大霉素肌內注射，2萬U/d，1次/d，連續(xù)注射3 d。對照組大鼠不做任何處理。所有大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～26 ℃，濕度為50%～70%。

圖1 電鉆鉆孔

圖2 WE43鎂合金植入

1.3 觀察指標

1.3.1 血常規(guī)、全血元素和肝腎功能指標的檢測：術后6個月，采用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射進行麻醉兩組大鼠后取腹腔靜脈血，留取全血2 mL并制備血清3 mL(以3 000 r/min離心7 min分離血清)，其中全血用于檢測血常規(guī)和全血元素，血清用于檢測肝、腎功能指標。血常規(guī)檢測項目為白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積和血小板計數(shù)，采用XE-5000全自動血細胞分析儀(SYSMEX株式會社)進行檢測，試劑盒均購自SYSMEX公司(批號：R0503、R0508、A0013、A0042、A0062)。全血元素包括鎂、鋅、釔、釹和鋯，采用美國賽默飛公司ICAP-RQ型電感耦合等離子體質譜儀進行檢測，所用的標準物均購自美國Inorganic Ventures公司(批號：N2-MG665351、N2-ZN664680、M2-Y02020R、N2-ND668817、M2-ZR663705)。肝功能檢測指標包括AST、ALT和堿性磷酸酶，腎功能檢測指標包括尿素氮、肌酐和尿酸，均采用LABOSPECT 008AS全自動生化分析儀(日立公司)進行檢測，試劑盒均購自WAKO公司(批號：003046、910868、004087、004085、910868)。

1.3.2 組織病理學觀察：采血后采用3%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)過量麻醉處死大鼠，取肝臟、腎臟和脾臟組織置于4%中性甲醛固定液48 h，然后進行沖洗、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中脫水3 min，使用蘇木精染色5 min后流水清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用0.5%伊紅液染色1～3 min，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，使用中性樹膠封固。使用Olympus-BX41顯微鏡進行觀察與拍照，制片和染色試劑為羅恩AR純試劑。

1.3.3 植入物降解情況及植入物周圍成骨情況：取鎂合金植入組大鼠左側股骨髁進行Micro CT掃描。采用比利時Bruker公司的SkyScan 1174型CT儀，以12 μm掃描分辨率對植入物樣本進行掃描。用N-Recon軟件進行三維圖像重建，用CT-AN軟件進行三維分析，計算植入物體積和觀察新骨生成情況。

1.4 實驗質量控制 按照動物飼養(yǎng)的要求規(guī)定，在飼養(yǎng)的過程中，密切觀察大鼠生長情況，避免大鼠生病或死亡，保證實驗的順利進行，并做好實驗記錄。 醫(yī)學檢驗實驗室已通過ISO15189實驗室質量認證，并按要求做好相關質控。

1.5 統(tǒng)計學分析 將實驗數(shù)據(jù)錄入Excel軟件，建立數(shù)據(jù)庫。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠血常規(guī)和肝腎功能指標的比較 兩組大鼠血常規(guī)與肝腎功能指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

組別nALT(U/L)AST(U/L)堿性磷酸酶(U/L)尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)尿酸(μmol/L)對照組626.48±5.62144.41±54.1350.62±9.975.72±0.6138.51±9.69244.38±61.67鎂合金植入組633.62±8.17146.40±37.2046.59±6.935.28±0.3239.29±2.87195.9±7.00 t值-1.767-0.0740.8131.565-0.1891.913P值0.3830.9620.6130.2930.8810.123正常參考范圍38.67～117.23108.01～340.2741.4～137.52.96～12.7240.30～84.12—

2.2 兩組大鼠全血金屬元素含量的比較 鎂合金植入組大鼠全血鎂、鋅含量略高于對照組，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；兩組大鼠全血中均未檢出釔、釹、鋯元素。見表2。

表2 兩組大鼠全血金屬元素含量的比較(x±s，mg/L)

2.3 兩組大鼠臟器組織病理學的比較 鎂合金植入組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞呈放射狀排列，肝組織形態(tài)正常，無明顯病理變化；腎小球體積正常，腎小管無明顯病變，結構清晰，上皮細胞大小一致，無增生，腎組織結構無異常改變；脾臟組織結構正常，沒有明顯變化。兩組大鼠臟器組織病理學比較無明顯差異，見圖3。

圖3 兩組大鼠的臟器組織病理學切片(HE染色，×100)

2.4 鎂合金植入組大鼠植入物體內降解情況 Micro CT掃描結果顯示，WE43鎂合金植入物植入股骨髁內6個月后已發(fā)生體內降解，WE43鎂合金植入物表面出現(xiàn)了明顯的降解性缺損(圖4A、圖4B)，進一步分析發(fā)現(xiàn)WE43鎂合金植入物周圍有明顯新骨質生成(圖4C)；應用測量軟件分析植入后的WE43鎂合金植入物體積，植入前WE43鎂合金植入物體積為(10.18±0.35)mm3，植入6個月后WE43鎂合金植入物體積為(7.65±0.56)mm3，WE43鎂合金植入物在大鼠體內降解丟失了約25%的原始體積。

圖4 Micro CT掃描圖

3 討 論

WE43鎂合金是目前研究較多的可降解骨生物材料之一，利用其體內降解性能制造出骨內固定器械，可以避免患者二次手術，并可降低醫(yī)療費用和手術風險[7-9]。血液檢驗是生物相容性研究的重要工作之一，血液指標的變化能夠較好地反映外科植入物可能對機體造成的不良影響。血常規(guī)能夠反映機體的生理、病理狀態(tài)，是臨床疾病診斷的主要檢查項目。由于動物品種、檢測儀器、試劑盒、實驗方法及動物年齡等多個因素的影響，動物血液指標檢驗結果差異較大[10-11]。Tie等[12]將鎂合金植入新西蘭大白兔股骨內， 發(fā)現(xiàn)鎂合金的降解過程對大白兔的血液學指標、心臟損傷和炎癥發(fā)生情況、肝功能、代謝過程等均無明顯影響。袁青領等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將鎂鋅合金植入大鼠盲腸對其肝腎功能與電解質無明顯影響，初步證實了鎂鋅合金的生物安全性。Wang等[14]將鎂合金植入慢性腎功能衰竭大鼠模型，結果顯示正常大鼠與慢性腎功能衰竭大鼠的血清、尿液、糞便和內臟中的鎂含量均無明顯變化，這提示鎂合金植入也不會對腎功能衰竭大鼠造成額外的損傷。本研究中，鎂合金骨植入組大鼠的血常規(guī)與肝腎功能指標雖然表現(xiàn)出部分變化，但與對照組大鼠比較均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，且大部分結果均在參考范圍內[15-21]，這提示W(wǎng)E43鎂合金骨植入對大鼠血常規(guī)和肝腎功能指標的影響較小，與上述研究結果類似。

全血金屬元素分析可以檢測鎂合金骨植入后在體內降解過程中釋放入血中的金屬離子濃度水平，用電感耦合等離子體質譜技術可以快速地分析血液中的痕量元素含量。鎂和鋅都是機體生存必需的元素之一，其中鎂元素還是骨組織代謝的元素之一[22]。研究表明，鎂合金有良好的骨誘導性,可促進骨折愈合[23]。本研究植入的WE43鎂合金中含有一定含量的鎂元素和鋅元素，但植入6個月后，與對照組大鼠相比，鎂合金植入組大鼠全血中的鎂、鋅元素含量并沒有大幅升高，表明WE43鎂合金骨植入對大鼠全血中金屬元素含量水平影響較小，沒有出現(xiàn)WE43鎂合金降解后血液中金屬元素含量顯著升高的現(xiàn)象。分析原因可能為：植入物本身鎂、鋅的含量不高，WE43鎂合金植入物的質量約為0.02 g,降解25%的釋放量約為5 mg，降解過程為6個月，降解時間較長，血液中的金屬元素含量少。此外，鎂、鋅元素可能隨汗液、尿液、糞便排出體外，從而達到動態(tài)平衡。王義生等[24]認為鎂離子降解后通過腎臟排出體外，且未對腎臟造成損害。本研究中未從大鼠血樣中檢出釔離子、釹離子和鋯離子，可能為WE43鎂合金在體內降解緩慢，而釔、釹、鋯元素在合金中含量很低，降解后的離子被機體吸收后通過尿、糞排出體外，全血中釔、釹、鋯元素含量水平低于設備檢測線。

WE43鎂合金可以在體內降解，降解產(chǎn)物須通過肝臟、腎臟等組織代謝排出體外，通過組織病理學觀察可以直觀地評估植入物降解可能對宿主器官產(chǎn)生的毒性損害。本研究結果顯示，WE43鎂合金骨植入6個月后，鎂合金骨植入組大鼠的肝臟、腎臟和脾臟組織結構未發(fā)生明顯異常改變，表明鎂合金骨植入未對大鼠的肝臟、腎臟和脾臟造成明顯的病理損害。Holweg等[25]觀察鎂合金接骨螺釘內固定用于綿羊骨折模型的效果，發(fā)現(xiàn)植入后12周綿羊的骨折完全愈合，認為植入物的降解過程不影響骨折愈合。Oshibe等[26]在大鼠脛骨中植入0.3 mm×10 mm的WE43鎂合金柱體，在植入12個月時發(fā)現(xiàn)其體積損失為36%，植入物周圍骨成熟，板層骨結構發(fā)育正常，這提示W(wǎng)E43鎂合金植入物在骨組織中具有良好的長期穩(wěn)定性和生物相容性。Byun等[27]采用Beagle犬截骨模型對WE43鎂合金骨板和螺釘?shù)男阅苓M行評價，在植入4周時可觀察到植入物發(fā)生降解，在植入24周時可觀察到鎂板被吸收，以及在鎂板和螺釘周圍形成的新骨。本研究的Micro CT掃描結果顯示，在植入大鼠股骨髁內6個月后WE43鎂合金植入物已發(fā)生明顯的體內降解現(xiàn)象，其在大鼠體內降解丟失約25%的原始體積，進一步觀察發(fā)現(xiàn)鎂合金植入物周圍有明顯新骨質生成。這提示W(wǎng)E43鎂合金骨植入后的體內降解可能有利于骨折修復，但是其具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，WE43鎂合金骨植入未對大鼠的血常規(guī)、肝腎功能與全血金屬元素含量造成明顯影響，也未對大鼠的肝臟、腎臟和脾臟造成明顯的病理損害，植入6個月后體內降解丟失約25%的原始體積，具有良好的組織相容性，可能有利于骨折修復。由于本研究樣本量較少，觀察時間較短，且為動物實驗，WE43鎂合金長期骨植入并在體內降解后的風險尚需進一步觀察和評估。